金樱子对实验性ⅠgA肾病大鼠MCP1mRNA表达的影响

amy54321 · 发表于 2014-8-19 18:10:27

   作者：黄艳明舒雨雁韦玉兰

【摘要】  目的研究金樱子水醇提取液对实验性ⅠgA肾病大鼠肾组织MCP1mRNA表达的影响，了解其作用机制。方法建立ⅠgA肾病大鼠模型，将36只动物随机分成正常组、模型组和治疗组，用RT-PCR方法检测各实验组肾脏组织MCP1mRNA表达。结果MCP1mRNA在3个实验组中的相对表达量分别为：(0.308 3±0.159 4),(0.873 2±0.501 7)，(0.418 2±0.193 3)，与模型组相比，金樱子治疗组能有效抑制MCP1mRNA在肾组织的表达(P＜0.05)。结论金樱子能下调MCP1mRNA在肾脏的表达，减少局部炎症反应，减轻肾脏损害，保护肾脏。

【关键词】  金樱子 ⅠgA肾病单核趋化蛋白因子

　　Abstract：ObjectiveTo study the effects of Rosa laevigata Michx on expression of MCP1mRNA in rat experimental ⅠgA nephropathy model renal tissue at level of gene which can help to understand mechanism of action. MethodsAfter IgA nephropathy model was established,36 rats were divided at random into normal group, model group and treatment group. The expression of MCP1mRNA in renal tissue by RT-PCR methods. ResultsThe expression of MCP-1mRNA in three groups were (0.308 3±0.159 4),(0.873 2±0.501 7),(0.418 2±0.193 3) respectively. Compared with model group,Rosa Laevigata Michx could inhibit the expression of MCP1mRNA ` in renal tissue(P＜0.05). ConclusionRosa laevigata Michx can decrease the expression of  MCP1mRNA in kidney, diminish local inflammatory reaction ,relieve renal loss and protect renal function.

　　Key words：Rosa laevigata Michx ;  ⅠgA nephropathy; MCP1

　　金樱子Rosa laevigata Michx含有皂苷、鞣质、甾体、萜类、多糖等生物活性物质。大量的实验证实［1，2］，金樱子的有效成分具有抗菌消炎、抗氧化、降血脂和增强免疫力的作用，我们已经研究了金樱子水醇提取液对IgA肾病大鼠炎症因子TGFβ的影响，实验证明该药能在转录水平上减轻细胞外基质中的胶原Ⅰ，Ⅱ，Ⅳ，FN等多种成分的合成，能缓解肾脏的纤维化和肾小球的硬化。在此基础上，本课题进一步探讨该药对肾组织中单核趋化蛋白因子(monocyte chemoatracttant pretein1,MCP1)mRNA的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  健康远交系雄性SD大鼠36只，体重180～200 g，由广西医科大学实验动物中心提供；牛血清白蛋白、Trizol、逆转录试剂盒由深圳晶美生物工程有限公司提供；葡萄糖球菌肠毒素（SEB）由军事医学科学院提供；TaqDNA聚合酶、dNTP由Takara生物公司提供。

　　1.2  方法

　　1.2.1  动物分组动物适应性饲养1周，检测尿蛋白，随机将36只SD大鼠分成正常组12只、模型组12只和金樱子治疗组12只。

　　1.2.2 ⅠgA肾病大鼠模型的建立  除正常组外，其余各组隔日用0.1%BSA酸化水（0.1%稀盐酸配制）100 mg/kg灌服，至处死日。第6,7两周，每周连续3 d 10 mg/kg尾静脉注射1%BSA缓冲液（无菌生理盐水配制），第8～10周，1次/周,0.4 mg/kg尾静脉注射SEB（无菌盐水配制）。正常组隔日饮用酸化水，第6～10周尾静脉注射与造模等量等次的生理盐水，然后观察至第15周。

　　1.2.3  给药方法动物给药从第11周开始，治疗组用金樱子水醇提取液按1 ml/200 g灌服；模型组和正常组每日用生理盐水灌服至处死日。其中模型组1只大鼠在尾静脉注射后第3周持续异常瘦弱摄食减少而死亡，已从实验中剔除。

　　1.3  大鼠MCP1 mRNA检测

　　1.3.1  肾组织总RNA提取  按照总RNA提取试剂盒说明书进行。

　　1.3.2  RTPCR引物的设计与合成：MCP-1引物由上海生工生物公司设计合成，上下游引物序列分别为5'-ATG CAG GTC TCT GTC ACG 3'，5'CTA GTT CTC TGT CAT ACT-3'，扩增产物长度为450 bp。βactin引物为内参，由上海生工生物公司合成，上下游引物序列分别为5'CTA TCG GCA ATG AGC GGT TC3'，5'CTT AGG AGT TGG GGG TGG CT-3'，扩增产物长度为762 bp。

　　cDNA合成：于一离心管中先加入总RNA 11 μl，随机引物1 μl,PCR反应仪70℃ 5 min ,然后按下列顺序加样：5×buffer 4 μl，dNTP(10 mM)2 μl，Ribonuclease inhibitor 1 μl，37℃ 5 min。然后加入MMULV（200 u/μl）1 μl，轻轻混匀，42℃ 温育60 min，72℃ 10 min灭活逆转录酶，-20℃保存备用。

　　多聚酶链反应：取上述各组逆转录产物按下列顺序加样：cDNA模板2 μl，TaqDNA聚合酶2U，βactin上下游引物各1 μl，MCP1上下游引物各1 μl，Buffer2.5 μl，dNT 1 μl，用无菌水补齐至25 μl。PCR反应仪上运行下列操作：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，56℃30 s，72℃30 s，35个循环，72℃7 min。

　　PCR产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳：用β-actin作内参照，紫外凝胶成像分析仪对电泳条带成像并保存，Quangtity-one分析软件分析积分光密度，计算MCP1电泳条带的积分光密度和β-actin积分光密度的比值。

　　1.4 统计学处理应用SPSS11.0统计软件，计量资料以±s表示，采用方差分析。　　2  结果

　　2.1  各组MCP1的RTPCR结果比较  结果见表1。

　　表1  各组MCP-1 RT-PCR结果比较（略）

　　与正常组比较，*P＜0.05;与模型组比较，△P＜0.05

　　从表1可以看出，正常大鼠肾脏组织MCP-1 mRNA的表达量处于较低水平，仅为0.308 3±0.159 4，与正常组相比，模型组肾脏组织的MCP1 mRNA表达有显著升高(0.873 2±0.501 7，P＜0.05)；而经过金樱子治疗后，MCP-1 mRNA的表达下降，差异显著(0.418 2±0.193 3，P＜0.05)；治疗组与正常组相比，无显著性差异(P＞0.05)。

　　2.2 RTPCR电泳结果结果见图1。

　　图1  各实验组MCP-1 RT-PCR电泳图（略）

　　3  讨论

　　IgA肾病是一种以肾小球系膜区IgA沉积为特征的免疫复合物肾小球肾炎，是导致慢性肾功能衰竭的最常见原因之一。肾小球肾炎的特点是白细胞浸润、系膜细胞增生、基质沉积，从而导致肾小球滤过率下降、蛋白尿的产生和肾小球硬化。单核细胞在肾小球肾炎的发病机理中发挥了重要作用。

　　单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoatracttant pretein-1,MCP1）是CC类细胞趋化因子，它与其受体发生特异性结合，通过细胞膜上G蛋白耦联的磷脂酰肌醇途径，将信号转入细胞内，对单核巨噬细胞具有特异性趋化激活作用，促进炎症反应的发生、发展［3］。有研究表明，MCP1可以通过活化NF-кB和激活蛋白酶1（AP1）途径促进肾小管上皮细胞IL-6的分泌和细胞间黏附分子1（ICAM1）的合成，且呈时间和剂量依赖性，说明MCP1在肾小管上皮细胞炎性反应起重要作用［4］。MCP1还可刺激血管内皮细胞产生IL-6促进了肾小球炎症的发展，这过程同样依赖于活化NF-кB途径［5］。此外，MCP1还能引起溶酶体酶、超氧化物阴离子的释放，直接参与肾脏的损伤。总之，MCP-1通过趋化激活单核细胞并促其分泌TGFβ等致纤维化的细胞因子，导致ECM在肾小球和肾小管中堆积，肾间质纤维化，促进肾小球硬化，最终造成肾衰竭。近些年来，MCP1在IgA肾病进展中的作用越来越受到大家的关注。

　　金樱子是蔷薇科蔷薇属的传统药用野生植物，是长绿灌木。金樱子的果实有药食两重性。经分析，金樱子富含维生素C、还原糖、苹果酸等几十种生理活性物质及黄酮类物质，并含有多种氨基酸、微量元素和矿物质。黄酮类物质具有降血糖、抗氧化、增强机体免疫力等药用保健作用［2］。中药研究表明，金樱子的果实有固精、缩尿等功能，并对阻止实验性的动脉粥样硬化有一定的功效［6］。本实验结果显示，MCP1 mRNA在IgA肾病模型大鼠的肾脏组织的表达显著增高，与有关的实验研究和临床观察结果是一致的，即MCP1在炎症的发生、发展中发挥重要作用；而经过金樱子水醇提取物治疗后MCP-1 mRNA的表达显著下降（P＜0.05），且与正常组相比无显著性差异（P＞0.05），提示金樱子可以从基因表达水平降低MCP-1在肾脏局部的产生，从而抑制单核细胞向肾小球炎症部位的迁移和黏附，或通过减少MCP1的产生进而抵制巨噬细胞释放溶酶体和一些促炎因子，减轻组织的炎症反应，从而达到延缓IgA肾病的进展，保护肾功能的作用。综上所述，金樱子在免疫抑制治疗方面是一种具有良好开发前景的天然药物。

【参考文献】
  　　［1］张庭廷，聂刘旺，刘爱民，等.金樱子多糖的免疫活性研究［J］.中国实验方剂学杂志，2005，11（4）：55.

　　［2］陈乃富，张莉.金樱子黄酮类化合物的初步研究［J］.中国林副特产，2005，5：2.

　　［3］唐琳，张玲.MCP-1和肾脏病［J］.国外医学泌尿系统分册，2002，22（5）：308.

　　［4］ ViedtC,DechendR,FeiJ,et al.MCP-1 induces inflammatory activation of human tubular epithelial cells:involvement of the transcription factors ,nuclear factor-кB and activating protein-1［J］.J Am Soc Nephrol ,2002,13(6)：1534.

　　［5］ Viedtc,VogelJ,AthanasiouT,et al.Monocyte chemoattractant protein-1 induces proliferation and interleukin-6 production in human smooth muscle cells by differdntial activation of nuclear factor-кB and activator protein-1［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2002,22(5-DechendR)：914.

　　［6］谢祥茂，丁小雯，魏璐雪.金樱子提取液对清除作用的体外实验的研究［J］.食品科学，2001，2：52

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