黄芩提取物抗炎镇痛耐缺氧及抗疲劳作用的研究

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        作者：熊娟 欧阳昌汉  黄胜堂

【摘要】  目的探讨黄芩苷对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。方法线栓法制备大鼠大脑中动脉局灶性脑栓塞模型，缺血2 h，再灌注24 h。评价神经功能状态，测定脑梗塞体积和丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和髓过氧化物酶（MPO）活性以及血脑屏障通透性。称重法测定组织脑水肿含量。结果黄芩苷能显著降低缺血再灌注后脑梗塞体积，改善神经功能状态，降低脑组织MDA、NO含量、血脑屏障通透性和脑水肿程度，升高SOD活性并降低MPO 活性，与模型组比较，具有显著性差异（P<0.05或P<0.01）。 结论 黄芩苷对大鼠脑缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，其机理与其清除氧自由基、抗炎和减轻脑水肿有关。

【关键词】  黄芩苷 脑缺血 再灌注损伤 脑水肿

　　Abstract:ObjectiveTo investigate the protective effect of baicalin on cerebral injury induced by transient focal ischemia and its mechanisms. MethodsTransient focal cerebral ischemia injury model in rats was induced by occlusion of the right middle cerebral artery for 2 h, followed by 24 h reperfusion. The infarction volume and neurological deficit determined by the methods of TTC staining and the Longa's score were used to evaluate the effect of baicalin on cerebral injury. The levels of malondialdehyde (MDA), nitric oxide (NO), activities of superoxide dismutase (SOD) and myeloperoxidase (MPO) and blood-brain barrier (BBB) permeability in brain were measured by spectrophotometer. The content of brain water was assayed by weighing method.ResultsPretreatment with baicalin markedly reduced brain infarction volume and neurological deficit induced by transient ischemic insult, inhibited MPO activity, decreased NO, MDA and brain water content, and BBB permeability, increased SOD activity.ConclusionBaicalin might play a protective effect on cerebral ischemia reperfusion injury through inhibiting inflammatory process, peroxidation and decreasing brain water contents.

　　Key words:Baicalin;  Cerebral ischemia;   Reperfusion injury;   Brain water content
   
　　黄芩Scutellaria baicalensis Georgi.是一种主要生长在我国北部的传统中药材，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等作用，其主要有效成分为黄酮类，包括黄芩苷（baicalin）、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素，其中以黄芩苷的含量最高。近年研究表明，黄芩苷具有抗炎［1］、抗氧化活性［2］，有理由推测它对缺血性损伤疾病具有保护作用。本室前期的研究已证实黄芩苷对心肌缺血再灌注损伤具有较好的保护作用［3］。本文探讨了局灶性脑缺血再灌注时黄芩苷对脑梗塞体积和脑水肿的影响，观察其对缺血性脑损伤是否也具有保护作用。同时，为了探讨黄芩苷的神经保护机制，我们探讨黄芩苷对血脑屏障通透性以及炎性细胞浸润等影响进行了研究。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物  健康雄性Wistar大鼠，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，体重250～280 g。

　　1.2  药品与试剂  黄芩苷(Baicalin,BA)，纯度>98%，购自中国药品生物制剂检定所，临用前以生理盐水配成所需浓度。超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）、髓过氧化物酶（MPO）试剂盒购自南京生物工程研究所，其余试剂均为国产分析纯。

　　1.3  方法

　　1.3.1  局灶性脑缺血再灌注模型制备  参照Longa等［4］建立方法。主要步骤：10%水合氯醛(350 mg/kg) 腹腔注射麻醉大鼠，分离、结扎并切断右侧颈外动脉，由颈外动脉残端沿颈总和颈内动脉缓慢插入头端膨大的尼龙栓线约18 mm，阻塞大脑中动脉入口造成缺血。缺血2 h后拔除栓线进行24 h再灌注；假手术组栓线只插入10 mm，其余步骤同模型组。动物苏醒后出现手术侧Homer征和对侧体运动障碍即为模型制备成功。

　　1.3.2  动物分组与给药  实验动物随机分为4组，即假手术组、模型组和药物组（60,120 mg/kg）。实验动物于缺血前30 min和再灌注后12 h两次腹腔注射受试药物，假手术组和模型组分别注射等容积的生理盐水。

　　1.3.3  神经缺陷评分和脑梗塞体积测定按照Longa 5分制评分标准于再灌注后24 h进行行为学评分［4］。脑梗塞体积的测定采用红四氮唑(TTC)染色法。大鼠于再灌注24 h后断头取脑速冻15 min，行2 mm厚的冠状切片，置于2% TTC 溶液中37℃孵育30 min。正常脑组织着深红色，梗塞脑组织不着色。10%甲醛固定24 h后数码相机拍照，应用图像分析系统测量脑梗塞面积并计算脑梗塞体积。水肿对梗塞体积的影响采用Swanson等方法进行纠正。

　　1.3.4   生化指标测定  再灌注24 h后，迅速将大鼠断头处死，取脑，制备10%脑组织匀浆。取部分匀浆，差速离心法提取脑线粒体：1 000 r/min 离心10 min，弃沉淀，取上清液以10 000 r/min 离心15 min，沉淀物为线粒体组分，加0.5 ml生理盐水制备线粒体组分悬液，－80℃保存待测。SOD，MPO，NO测定按照试剂盒说明书进行；MDA测定采用硫代巴比妥酸法；蛋白质测定采用考马斯亮蓝法。

　　1.3.5   脑组织含水量的测定  脑含水量用干湿重法测定。大鼠断头取脑后，左右半球分开，分别称湿重后，置于110℃ 烤箱内24 h，迅速测干重。脑含水量=(湿重－干重)/湿重×100% 。

　　1.3.6  血脑屏障通透性测定  大鼠处死前经股静脉注射2%伊文思蓝（Evans blue,EB），20 min后迅速断头取脑，左右大脑半球分开，去除皮质表面的蛛网膜、血凝块及脑室脉络丛，置于已知体积甲酰胺中，测定脑体积。继续加甲酰胺至脑体积的5倍，置37℃ 水浴48 h，在波长632 nm 处测定光密度值。甲酰胺作空白比色，根据标准曲线计算EB含量。

　　1.3.7  病理学观察  再灌注结束后大鼠经生理盐水及40 g/L多聚甲醛液灌流固定后开颅取脑，采用视交叉前缘作2 mm厚冠状切片，常规制片，苏木精-伊红染色并进行组织病理学观察。在梗塞区以一个高倍视野为一个单位面积，连续计数5个视野内中性粒细胞浸润的数目，取其平均值。

　　1.3.8  统计学处理  所有实验数据均以±s表示，用SPSS 10.0软件进行one-way ANOVA分析并以 t检验，P<0.05表示具有显著性差异。　　2  结果

　　2.1  BA对脑缺血再灌注后脑梗塞体积和神经缺陷评分影响  与模型组相比，BA大、小剂量组均可明显缩小脑缺血再灌注大鼠脑梗塞体积（P<0.05）；BA大剂量组还可明显改善神经缺血评分（P<0.05），结果见表1。

　　2.2  BA对脑缺血再灌注大鼠脑含水量和血脑屏障通透性影响  如表 2所示，脑缺血再灌注24 h后缺血侧大脑含水量和EB含量明显高于假手术组（P<0.01）。BA大剂量组可显著降低脑缺血再灌注所引起的脑含水量和EB含量的增加（P<0.05）。

　　2.3  BA对脑缺血再灌注大鼠脑组织MPO，NO以及线粒体组分SOD，MDA的影响  如表 3所示，BA(60,120 mg/kg)对大鼠缺血2 h再灌注24 h后脑组织线粒体组分中SOD活性的降低有明显的抑制作用，并且能显著抑制脑组织MPO活性、NO含量以及线粒体组分中MDA含量的增加（P<0.05或P<0.01）。

　　表1  黄芩苷对脑缺血再灌注大鼠脑梗塞体积和神经缺陷评分的影响（略）

　　与模型组比较，1）P＜0.05

　　表2  黄芩苷对脑缺血再灌注大鼠脑含水量和血脑屏障通透性影响（略）

　　与假手术组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2)P＜0.05；n=6

　　表3  黄芩苷对脑缺血再灌注大鼠组织MPO，NO以及线粒体组分SOD，MDA的影响（略）

　　与模型组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2)P＜0.05；3)P＜0.01;n=6

　　2.4  BA对脑缺血再灌注大鼠脑区中心粒细胞浸润的影响光镜下，假手术组细胞大小数目正常，间质无水肿。模型组神经元数目明显减少，残留神经元萎缩，核固缩深染，核溶解，间质水肿明显，梗塞灶周围有大量中性粒细胞浸润。BA大小剂量组与模型组相比，存活神经元数量较多，间质内轻度水肿，中性粒细胞浸润数明显减少，结果见表 4。

　　表4  黄芩苷对缺血再灌注大鼠脑区中心粒细胞浸润的影响（略）

　　与假手术组比较，1）P＜0.05,2)P＜0.01；n=6

　　3  讨论
   
　　大量研究证实，脑缺血再灌注引起脑组织损害的病理生理机制复杂，其发病过程涉及到多个环节，包括能量代谢衰竭、氧自由基产生、炎性因子和细胞释放等，最终导致神经细胞死亡。因此有效的神经保护剂应是能够多环节阻断再灌注损伤的发病机制，植物黄酮为这种效应的发挥提供可能性［5］。
   
　　大量研究证实，黄芩苷具有较强的抗氧化作用，能诱导机体增加SOD合成，清除多种自由基［2，3］。本实验结果表明，脑缺血2 h再灌注24 h后，模型组缺血侧脑组织SOD活性明显下降，MDA水平明显升高，进一步印证自由基参与脑缺血再灌注脑损伤过程。同时，本研究结果还发现，脑缺血前后应用黄芩苷可明显增加大鼠缺血侧脑组织SOD活性，降低MDA含量，说明黄芩苷在大鼠脑缺血再灌注脑损伤中具有清除自由基、抗脂质过氧化作用。脑缺血再灌注损伤所引起的脑水肿，主要由细胞毒性水肿和血管源性水肿组成，前者为脑细胞本身的肿胀，与Na＋ 和Ca2＋交换的失衡及缺血后炎症反应中释放大量自由基和细胞毒性酶类有关；后者是由于血脑屏障(blood－brain barrier，BBB)破坏所致的组织间隙水肿，与炎症反应产物如NO，自由基等存在密切关系［6］。BBB通透性增加，一方面加重脑水肿，另一方面也有助于炎性细胞和炎症因子通过BBB，促进炎症反应和细胞凋亡。
   
　　本研究显示，脑缺血再灌注后，缺血侧脑组织EB含量明显增加，提示脑缺血再灌导致机体血脑屏障通透性明显增加，进而引起组织水肿和炎性细胞浸润。黄芩苷给药组在降低脑梗塞体积的同时也降低血脑屏障通透性和脑水肿，保护脑缺血再灌注性损伤。总之，黄芩苷对脑缺血再灌注脑水肿和神经损伤具有保护效应，这种保护作用可能与其抗炎、抗氧化等有关，在临床应用方面具有一定的前景，值得进一步开发研究。

【参考文献】
  　　［1］ Shen YC, Chiou WF, Chou YC, et al. Mechanisms in mediating the anti-inflammatory effects of baicalin and baicalein in human leukocytes［J］.Eur J Pharmacol, 2003, 465(1～2)：171.

　　［2］ Gao Z, Huang K, Yang X, et al. Free radical scavenging and antioxidant activities of flavonoids extracted from the radix of Scutellaria baicalensis Georgi［J］.Biochim Biophys Acta, 1999, 1472(3)：643.

　　［3］ 欧阳昌汉, 吴基良, 李立中.黄芩甙对大鼠心肌缺血再灌注所致脂质过氧化损伤的保护作用［J］.咸宁医学院学报, 2001, 15(1)：32.

　　［4］ Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke, 1989, 20(1)：84.

　　［5］ Simonyi A, Wang Q, Miller RL, et al. Polyphenols in cerebral ischemia: novel targets for neuroprotection［J］.Mol Neurobiol, 2005, 31(1～3)：135.

　　［6］ Boje KM. Inhibition of nitric oxide synthase attenuates blood-brain barrier disruption during experimental meningitis［J］.Brain Res,1996,720(1～2)：75.