黑曲霉诱导子促进岩黄连悬浮细胞中生物碱的合成

amy54321 · 发表于 2014-8-19 16:44:15

  作者：程华张玉芹余龙江敖明章

【摘要】  目的为了提高岩黄连悬浮培养细胞中生物碱的产量。方法以不同浓度黑曲霉诱导子处理岩黄连悬浮培养细胞。结果生物碱的产量随着诱导时间的延长迅速提高，到第6天达到最大值；添加50 mg/L诱导子时生物碱产量最高，达到89.2 mg/L，比对照组高出2.5倍，当诱导子浓度进一步升高时，生物碱产量反而降低；随着诱导子浓度从0 mg/L增大到150 mg/L，细胞生物量反而逐渐减少。结论黑曲霉诱导子可促进岩黄连细胞中生物碱的合成，最佳诱导子浓度是50 mg/L；过高浓度的诱导子并不利于细胞生长和生物碱合成，细胞生物量的减少是导致生物碱产量下降的一个重要原因。该处理提供了一种简单有效的方法提高岩黄连细胞培养中生物碱的产量。

【关键词】  黑曲霉悬浮细胞培养岩黄连诱导子

　　Abstract：ObjectiveTo improve the production of alkaloids in Corydalis saxicola Bunting suspension cell cultures.MethodsElicitor prepared from Aspergillus niger was used to treat the suspension cells on day 12.ResultsThe results showed that the production of alkaloids increased with the extension of time after treatment and the greatest value of alkaloid production was obtained on day 6. Cultures treated with 50 mg/L elicitor generated the highest alkaloid production, 89.2 mg/L, which was about 2.5-fold of that in the control.Alkaloid production significantly decreased in response to increased elicitor concentration from 50 mg/L to 150 mg/L. When elicitor concentration increased from 0 to 150 mg/L, biomass of cultures inversely decreased.ConclusionThis elicitor is effective to enhance alkaloid biosynthesis in cell suspension cultures of C. saxicola and the optimal concentration for alkaloid biosynthesis is 50 mg/L. Higher concentration of the elicitor is unfavorable to not only cell growth but also alkaloid production. This decrease of biomass induced by higher concentration of elicitor is a main reason for the suppression of alkaloid production. This treatment provides a simple and effective approach to enhance alkaloid biosynthesis of C. saxicola cells.

　　Key words：Aspergillus niger;  Cell suspension cultures; Corydalis saxicola Bunting; Elicitor

　　真菌诱导子被广泛用于促进植物细胞中代谢产物的合成，在多种植物的悬浮培养细胞中显示出高效诱导性，成为近年来体外细胞培养生产有用天然产物的研究热点［1～3］。黑曲霉（Aspergillus niger）是一种广泛分布在土壤和空气中的真菌，由黑曲霉制备的诱导子被证明能促进多种植物细胞培养物中特定代谢产物的合成，Huang等［4］使用来源于黑曲霉的诱导子，提高了红豆杉细胞培养中抗癌药物—紫杉醇的含量，Namdeo等［5］利用黑曲霉诱导子提高了长春花细胞培养物中阿吗碱的产量。利用真菌诱导子激活植物细胞中的代谢途径已经成为提高植物细胞培养中目标产物产量的有效手段之一［4］。

　　岩黄连（Corydalis saxicola Bunting），紫堇科紫堇属植物［6，7］，多年生草本。全草含脱氢卡维丁（dehydrocavidine）、小檗碱（berberine）等多种活性成分［8］；具有显著的抗菌、消炎、镇痛和强安定作用，在民间作为治疗乙肝的特效药。我们已经建立岩黄连悬浮细胞培养体系［9］，为了提高培养物中生物碱的产量，本文以黑曲霉诱导子处理岩黄连悬浮培养细胞，研究其对生物碱合成和细胞生长的影响，发现黑曲霉诱导子能有效促进悬浮细胞中生物碱的合成。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料岩黄连细胞培养参考文献［9］方法。悬浮培养采用250 ml三角瓶培养，每瓶装培养基100 ml，接种后（25±1）℃恒温条件下（130±5）r/min摇床培养，细胞接种密度为10 g/100 ml (FW/V)，暗培养。诱导子在岩黄连悬浮细胞培养的中期（第12天）加入，对照组加入等体积蒸馏水。

　　1.2  诱导子的制备黑曲霉真菌诱导子的制备参考文献［4］方法。以糖浓度作为诱导子的浓度，用蒽酮法测定糖含量后备用。

　　1.3  生物碱含量测定生物碱的含量测定参考文献方法［10］。称取鲜细胞1 g，加入20 ml 75%酸性乙醇，超声提取3次，1 h/次，抽滤，取滤液1 ml，加入0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=5.4) 5 ml，以2 ml 0.05%溴甲酚绿作为显色剂，加入10 ml三氯甲烷萃取30 min，取有机相，加入适量无水Na2SO4脱水，用分光光度计在416 nm处测定其光吸收值；量取1 ml培养液，再以同样方法处理，取有机相测定光密度。以小檗碱作为标准品标示生物碱含量，所测得的生物碱的含量为细胞和培养液中生物碱含量之和。

　　1.4  细胞生长测定以细胞干重作为细胞生长的指标，测定方法同前。培养物经布式漏斗抽滤，用蒸馏水将残留的培养液冲洗干净，再次抽滤得到细胞鲜重（FW），然后将所得细胞置50℃烘箱干燥至恒重（约48 h），称重得到细胞干重（DW）。重复3次实验。

　　2  结果与分析

　　2.1  诱导子对生物碱合成的影响结果见图1。

　　图1  生物碱合成的时间曲线（略）

　　图1显示添加50 mg/L诱导子时岩黄连细胞培养中生物碱的合成情况。从图中可以看出，生物碱的产量随着诱导时间的延长迅速提高，到第6天达到最大值，此时比对照组高出2.5倍，之后生物碱产量缓慢降低。对照组中生物碱的产量在整个培养过程中逐渐升高，至培养末期(第9天)达到最高。

　　2.2 诱导子浓度对生物碱产量的影响结果见图2。

　　图2  诱导子浓度对生物碱产量的影响（略）

　　2.3  诱导子对岩黄连细胞生长的影响添加诱导子对岩黄连细胞的生长具有显著影响。从图3可以看到，添加诱导子后，细胞生长受到明显抑制。与对照组相比，诱导子处理组降低了细胞生物量。随着诱导子浓度的从50 mg/L增大到150 mg/L，细胞生物量逐渐减少。诱导子浓度为50mg/L时，生物量在处理后的第3天达到最高，为12.8 g/L。而对照组生物量在第6天达到最大，比同期添加50 ，100，150 mg/L诱导子组分别高15%，30%和40%左右。　　■ 0 mg/L诱导子；◆ 50 mg/L诱导子;▲ 100 mg/L诱导子； 150 mg/L诱导子

　　图3  诱导子对岩黄连细胞生长的影响（略）

　　3  讨论

　　在植物细胞培养中，诱导子被广泛用于提高次生代谢产物的产量。来源于真菌的细胞壁成分、多糖、单糖、糖蛋白等成分都可作为诱导子使用［11］。本实验中的诱导子，来源于黑曲霉，其主要成分为胞壁多糖，该诱导子可刺激岩黄连细胞中生物碱的合成，从而提高其产量。该结果与Zhang等［12～14］在红豆杉细胞培养中的结果相一致。

　　在岩黄连悬浮细胞培养中，高浓度的诱导子导致了较低的生物量，没有引起较高的生物碱产量。表明合适的诱导子浓度对生物碱的合成和细胞生长是至关重要的，过高浓度的诱导子并不利于细胞生长和生物碱合成，细胞生物量的减少是导致生物碱产量下降的一个重要原因。Matsumura等［15］研究发现，用诱导子处理水稻悬浮培养细胞，引起H2O2的大量产生，培养基碱化，导致细胞大量死亡。Lan等［16］认为诱导子诱导的细胞死亡对红豆杉悬浮培养细胞中紫杉醇的合成没有贡献作用。Piffanelli等［17］研究大麦悬浮细胞发现，生物和非生物的胁迫作用能激活与防卫反应和细胞死亡相关的MLO调控基因。Zhang等［12］用诱导子处理烟草悬浮细胞也发现会导致细胞死亡，并认为这与诱导子激活WIPK途径有关。本实验中，最佳诱导子浓度是50 mg/L，虽然导致了岩黄连细胞生物量的部分减少，但将培养物中生物碱产量提高了2.5倍，该处理提供了一种简单有效的方法提高岩黄连细胞培养中生物碱的产量，并为研究诱导子对岩黄连细胞的诱导机制打下基础。

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　　［4］ Huang Y F, Lan W Z, Chen C, et al.The role of lipoxygenase in elicitor-induced taxol production in Taxus chinensis cell cultures［J］.Process Biochem, 2005,40(8)：2793.

　　［5］ Namdeo A, Patil S, Fulzele D P. Influence of fungal elicitors on production of ajmalicine by cell cultures of Catharanthus roseus［J］.Biotechnol Prog, 2002, 18(1)：159.

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　　［12］ Zhang C H, Mei X G, Liu L, et al. Enhanced paclitaxel production induced by the combination of elicitors in cell suspension cultures of Taxus chinensis［J］.Biotechnol Lett,2000, 22(19)：1561.

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　　［14］ Yu L J, Lan W Z, Qin W M, et al. Oxidative Stress and Taxol Production Induced by Fungal Elicitor in Cell Suspension Cultures of Taxus Chinensis［J］.Biologia Plantarum, 2002, 45(3)：459.

　　［15］ Matsumura H, Nirasawa S, Kiba A, et al. Overexpression of Bax inhibitor suppresses the fungal elicitor-induced cell death in rice (Oryza sativa L) cells［J］.Plant J, 2003, 33(3): 425.

　　［16］ Lan W Z, Yu L J, Li M Y, et al. Cell death unlikely contributes to taxol production in fungal elicitor-induced cell suspension cultures of Taxus chinensis［J］.Biotechnol Lett, 2003, 25(1)：47.

　　［17］ Piffanelli P, Zhou F, Casais C, et al. The barley MLO modulator of defense and cell death is responsive to biotic and abiotic stress stimuli［J］. Plant Physiol, 2002, 129(3)：1076.

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