高效液相色谱法测定八角莲中鬼臼毒素的含量

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【摘要】  目的建立高效液相色谱法测定八角莲中鬼臼毒素含量的方法。方法采用高效液相色谱法，色谱柱为Diamonsiltm C18柱；流动相：甲醇-0.1 mol/L磷酸二氢钾水溶液（50∶50）；流速：1.0 ml/min；检测波长：290 nm。结果 鬼臼毒素在0.047 69～0.476 9 mg/ml呈良好线性关系（r=0.999 6），平均回收率为99.94%，RSD=1.71%（n=5）。结论 采用高效液相色谱法测定八角莲中鬼臼毒素的含量，操作简便、准确，专属性强。

【关键词】  高效液相色谱 八角莲 鬼臼毒素

　　Abstract：ObjectiveTo  establish a method  of  determining Podophllotoxin in Dysosma versipellis by  HPLC.MethodsHigh  Performance  Liquid  Chromatography  was  performed  Diamonsil C18. The   chromatography  conditions  were  as  follows:  methanol - 0.1mol/L monobasic potassium phosphate (50∶50) as  mobile  phase,  flow  rate  being  1.0ml/min  and  detecting  wavelength  was  290nm.ResultsA  good  linearity  of  Podophllotoxin  was  shown  in  range  of  0.047 69～0.476 9 mg/ml (r=0.999 6),  the  average  recovery  was 99.94% and RSD was 1.71%(n=5). ConclusionThe  method   can  supply  evidence  for  the  quality  evaluation  of  Dysosma  versipellis. It  is  simple  and  accurate.

　　Key words：HPLC；   Dysosma  versipellis；  Podophllotoxin
   
　　八角莲为小檗科植物八角莲Dysosma  versipellis（Hance.）M. cheng  （Podophyllum  versipelle Hance.）的根及根茎。具有清热解毒、化痰散结、祛痰消肿之功能。用于痈肿疔疮、瘰疬、咽喉肿痛、跌打损伤、毒蛇咬伤等。笔者曾对八角莲的性状、显微结构进行过研究［1］。本实验采用高效液相色谱法测定八角莲中鬼臼毒素的含量，为完善八角莲药材的质量标准及临床应用提供科学依据。

　　1  仪器与试药

　　1.1   仪器    戴安UltiMateTM3000型高效液相色谱仪，包括四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、变色龙（chromeleon）软件数据处理系统；岛津AUW120D分析天平（d＝0.1mg/0.01 mg）；UP5200H超声波清洗器（熊猫集团南京电子计量有限公司）。

　　1.2  试药   甲醇为色谱纯（中国上海陆都化学试剂厂）；磷酸二氢钾为分析纯。鬼臼毒素对照品（含量测定用，以93.5%计，批号111645－200301）由中国药品生物制品检定所提供；八角莲Dysosma  versipellis（Hance.）M. Cheng  （Podophyllum versipelle Hance.），由中南民族大学万定荣教授鉴定和提供。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件   Diamonsiltm C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.1 mol/L磷酸二氢钾（50∶50）；检测波长290 nm；流速1.0 ml/min；柱温30℃；灵敏度：0.1AUFS；理论塔板数按鬼臼毒素峰计算不低于1 500。

　　2.2  对照品溶液的制备   精密称取在五氧化二磷干燥器中减压干燥12 h的鬼臼毒素对照品适量，加甲醇制成每毫升约含0.5 mg的溶液，摇匀，微孔滤膜过滤（0.45 μm），得鬼臼毒素对照品溶液。

　　2.3  供试品溶液的制备   分别取八角莲根茎和根粉末（过3号筛）各约0.5 g，精密称取，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，放置12 h，称定重量，超声处理30 min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，微孔滤膜过滤（0.45 μm），得八角莲根茎和根的供试品溶液。

　　2.4  八角莲根茎和根HPLC谱图比较  分别取八角莲根茎和根供试品溶液10 μl，注入高效液相色谱仪中，对其HPLC图进行比较，由图1～4比较可以看出，八角莲根中基本不含鬼臼毒素成分。

　　图1  八角莲根茎HPLC图（略）

　　图2  八角莲根HPLC图（略）

　　图3  鬼臼毒素对照品HPLC图（略）

　　图4  空白溶剂HPLC图（略）

　　2.5  线性关系考察   精密称取在五氧化二磷干燥器中减压干燥12 h的鬼臼毒素对照品25.5 mg，置50 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀（0.51×93.5%＝0.476 9 mg/ml），精密量取溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，分别置10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，鬼臼毒素含量为横坐标，绘制标准曲线，统计学计算回归方程为：Y=0.011 08X＋8.678 2×10－3，r=0.999 6。结果表明，鬼臼毒素的进样量在0.047 69～0.476 9 mg/ml的范围内，浓度与峰面积呈良好线性关系。　　2.6  精密度实验   精密吸取鬼臼毒素对照品溶液10 μl，按上述色谱条件，连续进样5次，依次测定各峰的峰面积值，结果鬼臼毒素对照品RSD=0.24%，表明仪器精密度良好。

　　2.7  稳定性实验  精密吸取密封室温保存的八角莲根茎供试品溶液10 μl，分别于0，2，5，8，10 h进样，测定其峰面积值，计算RSD=0.84%（n=3），结果表明，供试品溶液在10 h内检测对结果无影响，稳定性良好。

　　2.8   重现性实验   取同一批八角莲根茎样品，按供试品溶液制备方法平行制备5份供试液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl，测定5份供试品中鬼臼毒素的含量，结果 RSD=1.50%。

　　2.9  样品测定   取3批八角莲根茎样品，按供试品溶液制备方法操作，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，用外标法测定，计算样品中鬼臼毒素的含量。结果见表1。

　　2.10   加样回收率实验    取已知含量的八角莲根茎样品5份，各约0.25 g，精密称定，分别加入鬼臼毒素对照品2.55 mg（2.55×93.5%＝2.3843 mg），按供试品溶液制备方法操作，照上述色谱条件测定，计算回收率，结果平均回收率为99.94%，RSD=1.71%。

　　表1  八角莲中鬼臼毒素的含量测定结果（略）

　　表2  八角莲中鬼臼毒素加样回收率测定结果（略）

　　3  讨论

　　3.1   八角莲中鬼臼毒素的含量与提取方法有关    八角莲的有效成分为鬼臼毒素，有文献报道八角莲经80%甲醇超声提取，测得鬼臼毒素的含量为0.94%［2］，采用文中所用的甲醇超声提取测得鬼臼毒素的含量为1.01%，结果表明，八角莲中鬼臼毒素的含量可能与提取溶剂、方法等有一定关系，值得进一步研究。

　　3.2   八角莲根中基本不含鬼臼毒素   通过比较八角莲根与根茎的HPLC图可以看出，八角莲根中基本不含鬼臼毒素，实验结果表明，主要是八角莲的根茎具有鬼臼毒素的抗癌抗病毒活性。
   
　　本法测定八角莲中鬼臼毒素的含量，样品预处理简单，有效成分分离良好，而且无其他成分干扰，对八角莲药材的质量控制有一定的参考价值。

【参考文献】
  　［1］ 陈 黎，陈吉炎，安志斌，等.八角莲的性状与显微鉴别［J］.中药材，2004，27（8）：558.

　　［2］ 俞培忠，姚莉韵，王丽平.HPLC法测定4种八角莲中鬼臼毒素的含量［J］.上海医科大学学报，1998，25（6）：452.