甘草酸二铵注射液对大鼠肾缺血/再灌注损伤的保护作用

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【摘要】  目的探讨甘草酸二铵（DG）对大鼠肾缺血/再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）的保护作用。方法采用切除右肾，夹闭左肾动脉60 min后恢复灌注的方法复制在体大鼠肾I/R损伤的模型，夹闭动脉前30 min静脉注射DG 15 mg/kg或DG 30 mg/kg。检测再灌注1 h和再灌注24 h后血清尿素氮（BUN），血肌酐（Scr）以及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1（IL-1）的水平以及再灌注24 h后肾组织丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的含量。结果DG能显著降低I/R导致的血清BUN和Scr的升高，减少TNF-α和IL-1的产生，提高肾组织SOD活性，减少MDA的生成。结论DG对肾I/R有明显的保护作用，其机制与DG减少脂质过氧化反应，减少细胞因子TNF-α和IL-1水平有关。

【关键词】  甘草酸二铵 肾缺血 再灌注损伤 细胞因子

　　Abstract:ObjectiveTo study the protective effect of diammonium glycyrrhizinate injection（DG）on renal ischemia/reperfusion (I/R) in rats.MethodsA model of renal I/R was made by clamping double renal pedical for 60 min and reperfusion for 24 h. The injection of DG (15mg/kg or 30mg/kg) was pretreated before renal ischemia. The leveles of serum urea nitrogen (BUN), serum creatinine (Scr), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1 (IL-1) in serum were detected after reperfusion for 1 h and 24 h respectively, and the content of MDA and SOD in renal tissuses were measured after reperfusion for 24 h.ResultsDG significantly decreased the level of BUN and Scr, decreased the concentration of TNF-α and IL-1 in serum. Pretreatment with DG also enhanced the activity of SOD, reduced the concentration of MDA in renal after I/R.ConclusionDG has significant protective effect on renal I/R and markedly improve the renal function. The mechanisms are associated with decrease the lipid peroxidation reaction and reduce the level of TNF-α and IL-1.

　　Key wordsiammonium glycyrrhizinate;  Renal ischemia;  Reperfusion injury;  Cell factor
   
　　急性肾功能衰竭（acute renal failure, ARF）占临床住院病人总数的2%～5%，死亡率高达30%～60%，而肾缺血/再灌注（ischemia/reperfusion/, I/R）损伤是导致ARF的重要因素，而且随着肾移植的广泛开展，肾I/R损伤也是影响肾移植手术成功的重要因素和移植肾功能恢复的主要原因［1］。因此，如何有效防治肾I/R损伤，也是临床研究的热点之一。甘草酸二铵（Dammonii Glycyrrhizinatis，DG）为18 α-甘草酸的铵盐制剂，具有很强的抗炎、抗过敏、保护膜结构和免疫调节作用。临床上用于病毒性肝炎和肝纤维化的治疗并取得了显著的疗效。近来研究发现，DG对心肌和脑I/R损伤有较好的保护作用［2］。但其是否有保护肾I/R的作用，目前尚未见报道。本实验采用大鼠在体肾I/R模型探讨DG对肾的保护作用。

　　1  材料和方法

　　1.1  药品、试剂及仪器甘草酸二铵注射液为连云港正大天晴制药有限公司产品，5 mg/ml，批号200512151；尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒为南京建成生物工程研究所产品；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1（IL-1）酶联免疫吸附试剂盒购自华美生物技术公司。其余药品和试剂均为市售分析纯。

　　1.2  实验动物分组及模型制备健康雄性Wistar大鼠32只，由湖北省医学科学院实验动物中心提供，体重（230±15）g，随机分为4组，每组8只。①假手术组：大鼠禁食12 h后，以20%乌拉坦1 g/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定。腹正中切口，分离双侧肾脏但不夹闭，80 min后关闭腹腔；②I/R组：大鼠麻醉分离双侧肾脏后，切除右侧肾，用无肾损伤动脉夹夹闭左肾动脉，60 min后恢复灌注，然后关闭腹腔，缝合切口，再灌注24 h后结束实验［3］；③DG1组：肾动脉夹闭前30 min静脉注射DG 3 ml/kg，其余步骤同I/R组；④DG2组：肾动脉夹闭前30 min静脉注射DG 6 ml/kg，其余步骤同I/R组。

　　1.3  实验方法

　　1.3.1  血清BUN，Scr和TNF-α及IL-1的测定大鼠再灌注1 h和再灌注结束后分别取静脉血制备血清，BUN，Scr按试剂盒说明采用全自动生化分析仪检测，TNF-α和IL-1采用酶联免疫吸附法（ELISA）进行测定。

　　1.3.2  肾组织MDA和SOD的测定再灌注结束后取肾组织提取匀浆，按试剂盒操作说明测定。

　　1.4  统计学分析实验数据±s表示，以SPSS 11.0 for windows软件包作统计学分析并制作图表，组间、组内差异比较采用方差分析，P<0.05为显著性标准。v　　2  结果

　　2.1  DG对大鼠肾I/R后血清BUN，Scr的影响再灌注1 h和再灌注24 h后I/R组血清BUN和Scr较假手术组明显增加（P均<0.01），再灌注后1 h静脉注射DG的治疗组血清BUN和Scr均显著低于I/R组（BUN：P<0.05或P <0.01，Scr：P<0.01），再灌注24 h后静脉注射DG的两组BUN和Scr含量也明显低于I/R组（P<0.01）。结果见表1。

　　表1  DG对大鼠肾I/R后1 h及24 h    血清BUN和Scr的影响（略）

　　与Sham组比较，▲▲P<0.01；与I/R组比较，■P<0.05,■■P<0.01；n=8

　　2.2   DG对大鼠肾I/R后血清TNF-α及IL-1的影响再灌注1 h后I/R组血清TNF-α和IL-1较假手术组明显增加（P均<0.01），静脉注射DG的治疗组血清TNF-α和IL-1较I/R组显著降低（TNF-α：P<0.05或P<0.01，IL-1：P<0.05或P<0.05），再灌注24 h后I/R组TNF-α和IL-1的含量较再灌注1 h明显下降，但仍明显高于假手术组（P<0.01），DG治疗组TNF-α水平较I/R组显著下降（P<0.05），但DG 3 ml/kg治疗组IL-1含量较I/R组没有区别，而DG 6 ml/kg治疗组和假手术组一样没有检测出IL-1。结果见表2。

　　2.3  DG对大鼠肾I/R后组织MDA和SOD的影响再灌注24 h I/R组肾组织中MDA含量较假手术组明显增多而SOD活性显著下降（P<0.01）；给予DG的2个实验组较I/R组能明显提高SOD的活性（P<0.05或P<0.01），而且DG 6 ml/kg组较I/R组还能明显减少组织MDA含量（P<0.05），见表3。

　　表2  DG对大鼠肾I/R后1 h及24 h血清TNF-α和IL-1的影响（略）

　　与Sham组比较，▲▲P<0.01；与I/R组比较，■P<0.05,■■P<0.01；n=8

　　表3  DG对大鼠肾I/R后24 h肾组织MDA和SOD的影响（略）

　　与Sham组比较，▲▲P<0.01；与I/R组比较，■P<0.05,■■P<0.01；n=8

　　3  讨论
   
　　离体和在体实验均已证实氧自由基（oxygen free radical, OFR）大量产生及清除障碍是导致再灌注肾脏损伤的重要机制之一［4］。在实验中观察到，肾再灌注期SOD活性明显下降，提示内源性OFR的清除体系受到损害；组织MDA的含量大量增加。肾I/R后还导致肾功能的显著下降，血清BUN和Scr明显升高，表明再灌注时OFR清除障碍已造成膜脂质过氧化，损害了肾脏的结构和功能，而预先给予DG能显著提高SOD活性，减少MDA的生成量；减轻再灌注损伤导致的肾功能下降。由此认为DG能减轻I/R肾功能损害，对肾脏I/R有明显的保护作用，其机制之一可能与其提高抗氧化酶活性、减少脂质过氧化反应及保护细胞的结构完整性有关。
   
　　TNF-α和IL-1是调节炎症的主要细胞因子，研究认为它们在肾I/R的发生和发展过程中发挥重要作用。IL-1可导致中性粒细胞向肾组织浸润，加剧肾组织损伤。而TNF-α有直接的细胞毒作用，而且能促进IL-1等细胞因子的产生，诱导炎性细胞浸润和聚集，TNF-α还能上调血管粘附分子-1的表达，促进氧自由基生成，上述因素均加重肾组织的炎症反应，加剧组织损伤［5］。实验表明DG能显著减少肾I/R后TNF-α和IL-1，由此提示DG能减少I/R导致的炎性细胞浸润和聚集，减少肾组织的炎症反应，这与DG抗病毒性肝炎作用机理一致。
   
　　王会玲等［6］报道DG对马兜铃酸（aristolochic acid, AA）致培养肾小管上皮细胞有明显的保护作用，可改善AA对上皮细胞增殖的抑制作用，减轻AA对细胞的毒性作用。由于近来研究还表明DG对心脑缺血性疾病有明显的保护作用，因此将DG应用于肾I/R损伤的防治，为开发DG新的临床适应症提供了理论依据。

【参考文献】
  　　［1］ Jo SK, Sung SA, Cho WY, et al. Macrophages contribute to the initiation of ischaemic acute renal failure in rats［J］.Nephrol Dial Transplant. 2006,21(5): 1231.

　　［2］ 蒋建刚，吴基良，陈金和.甘草酸二铵对大鼠心肌缺血再灌注损伤在心室功能的影响［J］.医药导报， 2001，20(5): 282.

　　［3］ Matsuyama M, Hayama T, Funao K, et al. Treatment with edaravone improves the survival rate in renal warm ischemia-reperfusion injury using rat model［J］.Transplant Proc,2006，38(7): 2199.

　　［4］ Sener G, Sehirli O, Velioglu-Ogunc A, Cetinel S, et al. Montelukast protects against renal ischemia/reperfusion injury in rats［J］.Pharmacol Res. 2006,54(1): 65.

　　［5］ Carden DL, Granger DN. Pathophysiology of ischaemia-reperfusion injury［J］.J Pathol,2000，190:255.

　　［6］ 王会玲，张金元.甘草酸二铵对马兜铃酸致肾小管上皮细胞损害保护作用的实验研究［J］.东南国防医药，2004，6(5): 325.