反相高效液相色谱法测定岩黄连药材中岩黄连碱的含量

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作者：韦记青 蒋伟哲 蒋水元 蒋运生  李倩兰 凌玲

【摘要】  目的建立岩黄连药材中岩黄连碱的含量测定方法。方法采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法，以乙腈∶水（50∶50，内含0.34%磷酸二氢钾和0.17%十二烷基硫酸钠）为流动相，流速为1 ml/min, 检测波长为347 nm，柱温20℃，进样量为20 μl,外标法计算含量。结果岩黄连碱在0.140 4～2.808 μg内峰面积与对照品的进样量呈良好的线性关系，其回归方程为 Y=2×106X-5 639.1(r=0.999 98)。平均回收率分别为98.8%,99.4%,99.3%，RSD分别为1.27%，1.11%，1.06% 。结论所建立的RP-HPLC含量测定方法简便、准确、专属性强、重现性好。为控制药材岩黄连质量标准提供了依据。

【关键词】  岩黄连碱 反相高效液相色谱法

　　Abstract：ObjectiveTo develop a new method for determination of the content  of dehydrocavidine in Corydalis saxicola Bunting.MethodsThe content of dehydrocavidine in C. saxicola Bunting was determined by RP-HPLC，using acetonitrile-water(V∶V＝50∶50, 0.34％ potassium dihydrogen phosphate and 0.17% sodium lauryl sulfate ) as mobile phase,1 ml/min, with 347 nm of detection wavelength, the temperature was 20℃. The injection volume was 20 μl and the external standard was used. ResultsThe linear range was  within 0.140 4～2.808 μg and the correlation cofficient was 0.999 98.The average recovery and RSD were 98.8%，99.4%，99.3%and 1.27%，1.11%，1.06%, respectively.ConclusionThe method is simple, accurate, specific and precised. It is suitable for the the quality control of the Corydalis saxicola Bunting.

　　Key words：Dehydrocavidine;   RP-HPLC
   
　　岩黄连Corydalis saxicola Bunting，又名石生黄堇，紫堇科紫堇属多年草本植物［1～3］。具有显著的抗菌、消炎、镇痛和安定作用，是桂西北山区常用消炎止痛、排毒、 治疗急慢性肝炎和肝硬化等疾病的一种中草药［2，3］，其化学成分含有［4］：脱氢卡维丁(dehydrocavidine),小檗碱（berberine），(±)cavidine，(±)thalictrifoline,dehydrocavidine，(-)13β-hydroxystilopine，(+)四氢巴马汀［(±)tetrahydropalmatine］，(-)斯库来碱［(-)scoulerine］，白屈菜红碱（chelerythrine），(-)四氢非洲防己胺［(-)tetrahydrocolumbamine］，原阿片碱（protopine）,卡维丁,延胡索甲素等多种生物碱，其主要活性成分为岩黄连碱（C21H20O4N，即脱氢卡维汀），生物碱含量高低直接影响药材质量和疗效。岩黄连植物分布局限于石灰岩山区，属石山特有种［3］。目前，国内外对岩黄连的研究主要集中在岩黄连总生物碱的成分分析［5］ ，引种栽培［2～6］和药理作用［7～10］的研究，而对不同地区的岩黄连中岩黄连碱含量差异的研究未见报道。本实验主要建立了岩黄连中岩黄连碱含量测定方法，并对不同地区的岩黄连中岩黄连碱含量进行测定，为岩黄连质量考查提供参考，这对于指导岩黄连的标准化种植及合理采收具有重要意义。

　　1  仪器与试药

　　1.1  仪器LC-9000D高效液相色谱仪（南宁威玛龙色谱科技有限公司），Sartorius  ME215S(德国赛多利斯)电子天平，B3200S超声处理器（上海必能信超声有限公司）, RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

　　1.2  试剂乙腈(色谱纯, 美国TEDIA公司,Lot 506126), 甲醇(色谱纯, 天津四友生物医学技术有限公司)，磷酸二氢钾（分析纯，SCRC国药集团化学试剂有限公司，批号：Lot.No.F20051215），十二烷基硫酸钠（分析纯，北京化学试剂公司，批号：020304 ），水为高纯水， HCl（分析纯，广东省廉江市爱廉化试剂有限公司，批号：051018－2）,氨水（分析纯，广东光华化学厂有限公司，批号：20051222），氯仿（分析纯，成都市科龙化工试剂厂，批号:20051228）。

　　1.3  试药岩黄连碱对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号111651-200301，供含量测定用）；药材岩黄连供试品（东兰县达文村示范基地、东兰县隘洞镇拉板村、东兰县兰木乡同仕村提供）。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件与系统适用性实验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈∶水（50∶50，内含0.34%磷酸二氢钾和0.17%十二烷基硫酸钠）为流动相，检测波长为347 nm，理论塔板数按岩黄连碱峰计算应不低于6 000。

　　2.2  对照品溶液的制备  准确称取岩黄连碱对照品适量，精密称定，加流动相制成每毫升含25μg岩黄连碱的溶液，即得。

　　2.3  供试品溶液的制备取本品约10 g，剪碎，加入20倍量1％HCl溶液，煎煮30 min，取水提液，药渣再重复上一步骤，过滤，合并两次水提液，加氨水调pH至10，析出沉淀，过滤得清膏，80℃干燥2 h，加入20倍量氯仿回流提取30 min，过滤，得黄绿色澄清液体，将滤液减压蒸馏，挥干氯仿，精密加入25.0 ml流动相超声溶解，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，稀释25倍(取1 ml用流动相定容至25 ml容量瓶)，即得。

　　2.4  阴性对照溶液的制备以2.1项的流动相为阴性对照溶液。

　　2.5  阴性干扰实验精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20 μl注入液相色谱仪中，色谱图见图1。由色谱图可知，在与对照品色谱峰保留时间相应的位置上，供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰出现，而阴性液在此峰位无吸收，对本品中岩黄连碱的测定无干扰。　　2.6  标准曲线的制定称取岩黄连碱7.02 mg，置10 ml量瓶中，加流动相使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液。吸取上述对照品贮备溶液 0.1，0.2，0.5，1.0， 2.0 ml，分别置10.0 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，分别作为对照品溶液(浓度分别为7.02，14.04，35.1，70.2，140.4 μg/ml）, 按色谱条件分别进样测定(进样量20 μl)。以岩黄连碱对照品进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，则回归方程为：
   
　　Y=2×106X-5 639.1(r=0.999 98)
   
　　结果表明：当进样量在0.140 4～2.808 μg范围内时，岩黄连碱进样量与峰面积呈良好的线性关系。结果见表1。标准曲线见图2。

　　图1  对照品、供试品和阴性对照品的HPLC图（略）

　　表1  线性关系（略）

　　图2  标准曲线（略）

　　2.7  精密度实验取 “2.6”项下对照品，分别连续测定6次，结果岩黄连碱峰面积值的RSD小于 2 %。结果见表2。实验表明，本法的精密度良好。

　　表2  精密度实验结果（略）

　　2.8  重复性实验 精密量取同一供试品(东兰县隘洞镇拉板村)9份（低、中、高剂量各3份），按“2.3”项方法操作，分别进样20μl，测得岩黄连碱色谱峰面积，计算RSD。结果见表3。

　　表3  重复性实验（略）

　　2.9  稳定性实验取同一份供试品溶液(东兰县隘洞镇拉板村)，每隔一定时间测定1次，共测定5次。结果见表4。实验表明，在12 h内，供试品溶液稳定。

　　表4  稳定性实验结果（略）

　　2.10  加样回收率实验称取岩黄连碱对照品约10 mg，精密称定,置 50 ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。按“2.3”项下方法制备已知含量样品(东兰县隘洞镇拉板村)，分别加入上述岩黄连碱对照品溶液3.0，5.0，7.0 ml，按拟订的方法制备供试品溶液，共平行制备9份，分别进样测定，按下式计算回收率。结果见表5。
   
　　回收率（%）=测得量（mg）-样品量（mg）加入对照品量（mg）×100%

　　表5  加样回收率实验结果（略）

　　2.11  含量测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。结果见表6。

　　表6  岩黄连药材含量测定（略）

　　3  讨论
   
　　本实验采用岩黄连碱为季胺类生物碱，极性较大，用普通的离子抑制色谱法无法达到良好的分离。因此采用了离子对色谱法，加入十二烷基硫酸钠作为离子对试剂，抑制其解离，能达到良好的分离效果。最后我们发现以乙腈－水为流动相，改变流动相配比进行最佳流动相的选择，结果表明，岩黄连碱在乙腈∶水（50∶50，内含0.34%磷酸二氢钾和0.17%十二烷基硫酸钠）为流动相与相邻组分峰分离度R>1．5，达到分离要求，能完全满足色谱峰定量要求。
   
　　不同产地药材含量测定结果表明，东兰县达文村示范基地所产岩黄连中岩黄连碱含量最高，东兰县隘洞镇拉板村所产含量次之，而东兰县兰木乡同仕村所产含量最低。
   
　　本实验采用经典的酸提碱沉法提取岩黄连中岩黄连碱，制成清膏后采用甲醇、醋酸乙酯和氯仿进行回流提取，结果发现用氯仿回流其提取率大于用乙醇、醋酸乙酯提取，最后采用了氯仿作为提取溶剂。

【参考文献】
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　　［2］ 蒋水元，胡兴华，赵瑞峰．岩黄连引种栽培研究［J］.广西植物，2002，22(5)：469．

　　［3］ 文和群，许兆然，J.Villa-Lobos，等．中国南部石灰岩稀有濒危植物名录［J］.广西植物，1993，13(2)：110．

　　［4］ 柯珉珉．岩黄连有效成分的研究［J］.药学通报，1980：15(6)：41．

　　［5］ 柯珉珉，张宪德，吴练中，等．岩黄连有效成分的研究［J］.植物学报，1982，24(3)：289．

　　［6］ 陈祖强．广西栽培与野生岩黄连的质量比较研究［J］.广西植物，1993，13(2)：188．

　　［7］ 陈重阳，赵 一.岩黄连脱氢维丁药理研究［J］.中药通报，1982，7（2）：31.

　　［8］ 叶琦莉，吴练中，李 辉，等.岩黄连的主要成分脱氢卡维丁的抗菌实验［J］.广西中医药，1984，7（3）：48.

　　［9］ 黄燮南，刘国雄，张 毅，等.岩黄连总生物碱的安定作用［J］.中国药理学报，1981，2（3）：156.

　　［10］ 韦记青，蒋水元，蒋运生，等.药用植物岩黄连研究概述［J］.广西科学院学报，2006，22（2）：108.