冻干保护剂对HB有效组分脂质体包封率和粒径的影响

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         作者：刘娟 胡水根  卞俊 汪国华 柯乾坤

【摘要】  目的研究不同冻干保护剂种类和浓度对HB有效组分脂质体冻干前后包封率和平均粒径的影响。方法按16个处方制备了HB有效组分脂质体，采用荧光分光光度法测定包封率，用显微镜和数码图象分析软件测定了平均粒径，通过冻干前后脂质体包封率和粒径的比较优选出最佳的冻干保护剂。结果最佳冻干保护剂为甘露醇和二元保护剂蔗糖-甘氨酸，包封率达到69.91%和66.70%，外观效果良好，比例分别为，甘露醇∶PC∶CH∶HB = 4∶1∶0.5∶0.2；蔗糖∶甘氨酸∶PC∶CH∶HB = 4∶0.8∶1∶0.5∶0.2。结论 冻干保护剂可减少脂质体囊泡在冻干过程受到的破坏以及对脂质体包封率和粒径的影响。

【关键词】  脂质体 冻干保护剂 包封率 粒径

　　Abstract：ObjectiveTo study the effects of freeze-drying on the endcapsulation and vesicles size of HB liposome with different kinds of lyoprotectents at various concentrations.MethodsSixteen formulations of HB liposome were designed.The entrapment efficiency was examined by fluorospectrophotometry.The particle size of the preparation was examined by microscope and digital imaging analysis software.The optimized lyoprotectent was selected based on the comparison of entrapment efficiency and particle size before and after freeze-drying.ResultsThe use of sucrose as a primary lyoprotectent and glycine as a supporting lyoprotectents and the use of mannitol provided the highest encapsulation rate and minimal change of HB liposomes.The results showed that the optimum formula were Man∶PC∶CH∶HB = 4∶1∶0.5∶0.2; Suc∶Gly∶PC∶CH∶HB = 4∶0.8∶1∶0.5∶0.2,the encapsulation rates were 69.91% and 66.70%.ConclusionThe lyoprotectent can protect the liposome vesicles during freeze-drying and mininal the influences of encapsulation and particle size.

　　Key words：Liposome;  Lyoprotectents;  Entrapment efficiency；  Particle size
   
　　HB有效组分是从海洋湖沼类贝壳软体动物园背角无齿蚌anodonta woodiana (Lea)中提取的一组具抗肿瘤活性的糖蛋白类物质。将该有效组分制成了脂质体后，经小鼠移植性肿瘤体内实验表明，口服具有抗肿瘤活性，对S180肉瘤，Lewis肺癌，黑色素B16肺转移癌的抑瘤率分别为48.76%,54.38%,52.66%［1］。但液态的HB有效组分脂质体是混悬乳剂，只能贮存几周［2］，在50℃以上的介质环境中，结构不稳定，磷酯双分子层结构易氧化破坏，不仅影响药物包封率，且生成的溶血磷脂会危害机体［3］。为使脂质体能在常温下长期稳定贮存，近年来广泛用冷冻干燥技术制备冻干品。冷冻干燥法是目前制备储存脂质体的最佳方法。但在冷冻过程形成的冰晶使脂质体聚集融合，在冷冻和解冻过程中，膜内外冰晶形成速度不同引起渗透压差，造成脂质体裂解，所以在冷冻干燥过程中，应加入冷冻保护剂（CAP）以减少破坏。此法解决了脂质体制备过程和储存中的物理稳定性和渗漏问题，并避免了不稳定药物的失活、分解［4］。本实验在制备脂质体中加入荧光素，预实验中发现药物和荧光素存在着一样的包封几率，所测的荧光素包封率和药物包封率基本一致，所以本实验采用荧光分光光度法测定药物包封率。
   
　　前文［5］已报道过对HB-Ⅰa冻干脂质体粒径及其分布的研究，本部分主要阐述不同冻干保护剂对HB有效组分脂质体在包封率、外观形态、粒径的影响，为建立一种稳定的脂质剂型和脂质体的贮存、包装、运输等方面开辟良好的途径。

　　1  仪器与试药

　　1.1  仪器SENCO R系列旋转蒸发器（上海申生科技有限公司），JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司），Z233MK-2 低温高速离心机 (HERMLE)，F-3000荧光分光光度计（HITACHI），AR2140电子分析天平（奥豪斯公司），SZ-93 自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂），DM LB2 显微镜（LEICA），QWIN V3数码图象分析软件（LEICA），YRD1501A真空冷冻干燥机（安装功率：6.7 kW，上海玉成干燥设备有限公司）。

　　1.2   试药胆固醇（cholesterol, CH, 分析纯，上海新兴化工试剂研究所，批号030318），大豆卵磷脂（Soybean Lecithin, Serva进口分装，生化试剂，上海伯奥生物科技公司，批号050314），荧光素（Fluorescein，分析纯，上海华东师范大学华工厂，上海灵锦精细化工有限公司，批号20041212），HB（自制），蔗糖（Sucrose，分析纯，上海试剂总厂，批号68-01-06），甘氨酸（Glycine，生化试剂，上海南翔试剂有限公司，批号031010），甘露醇（Mannitol，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号F20050527），山梨醇（D-Sorbitol，生化试剂，上海试剂二厂），海藻糖（Trehalose，生化试剂，上海熔岩精细化工有限公司，批号040801），聚乙烯吡咯烷酮（K30）（Polyvinlpyrrolidone，进口分装，国药集团化学试剂有限公司，批号F20050531）。
   
　　磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O，分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司），磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O，分析纯，江苏太仓化工二厂），磷酸盐缓冲液（PBS）：15 mmol·L-1氯化钠，0.2 mmol·L-1Na2HPO4·12H2O～0.2 mmol·L-1NaH2PO4·2H2O（81∶19），pH 7.4。

　　2  方法与结果

　　2.1  冻干保护剂的选择方案

　　实验处方设计PC∶CH∶HB=500 mg∶250 mg∶100 mg1 Suc∶PC∶CH∶HB =4∶1∶0.5∶0.22 Suc∶PC∶CH∶HB =2∶1∶0.5∶0.23 Gly∶PC∶CH∶HB = 4∶1∶0.5∶0.24 Gly∶PC∶CH∶HB = 2∶1∶0.5∶0.25 Man∶PC∶CH∶HB = 4∶1∶0.5∶0.26 Man∶PC∶CH∶HB = 2∶1∶0.5∶0.27 D-Sor∶PC∶CH∶HB = 4∶1∶0.5∶0.28 D-Sor∶PC∶CH∶HB = 2∶1∶0.5∶0.29 Tre∶PC∶CH∶HB=4∶1∶0.5∶0.210 Tre∶PC∶CH∶HB=2∶1∶0.5∶0.211 Suc∶Gly∶PC∶CH∶HB = 4∶0.8∶1∶0.5∶0.212 Suc∶Man∶PC∶CH∶HB = 4∶0.8∶1∶0.5∶0.213 Suc∶D-Sor∶PC∶CH∶HB = 4∶0.8∶1∶0.5∶0.214 Suc∶Tre∶PC∶CH∶HB = 4∶0.8∶1∶0.5∶0.215 Suc∶PVP∶PC∶CH∶HB = 4∶0.8∶1∶0.5∶0.216 PC∶CH∶HB = 1∶0.5∶0.2

　　2.2  HB有效组分脂质体的制备采用逆相蒸发法制备，取处方量的PC和CH溶于乙醚10 ml；另取HB、冻干保护剂、荧光素1ml（8 μg/ml） 溶于5 ml生理盐水中，将两溶液混合于茄形瓶中，探针超声30 s（每超声15 s，间歇4 s）；40℃下减压旋转蒸发除去乙醚，至成黏稠溶液后再加入5 ml生理盐水，探针超声60 s（每超声15s，间歇4s）；继续常压旋转蒸发1 h, 得HB有效组分脂质体混悬乳浊液。

　　2.3  冷冻干燥工艺取各处方脂质体混悬液1 ml，各3份，分别置于2.5 ml西林瓶中，热电偶分布于瓶底。预冻过程，在2 h内，样品温度达到-50℃。抽真空，保持真空度在10 Pa左右，进行第1次干燥过程（升华阶段），持续17 h，此时样品温度由-50℃升到2.4℃，搁板温度保持在10℃。升高搁板温度到40℃，进行第2次干燥过程（解析阶段），持续8 h，冻干过程结束。冻干曲线见图1。

　　图1  冻干曲线（略）

　　2.4  荧光分光光度法测定包封率

　　2.4.1  荧光强度标准曲线的绘制取适量荧光素配制成浓度为0.8 μg·ml-1的母液，精密吸取母液1，10，20，100，1 000 ml分别置于1 000 ml容量瓶中，用重蒸馏水稀释至刻度，配制成浓度分别为0.000 8，0.008，0.016，0.08 ，0.8 μg·ml-1的系列溶液，以水为空白，于Ex=490 nm；Em=510 nm波长处测定F值，以F值与浓度作标准曲线。结果表明荧光素标准溶液在0.000 8～0.8 μg·ml-1浓度范围线性良好，回归方程为：Y =8 822.8X +310.95，r =0.999 8。　　2.4.2  供试品的制备取未冷冻干燥的各处方脂质体混悬液1 ml，各3份，在T=10℃；t=15 min；V=15 000 r/min离心，取上清液定容至5 ml，作为供试品A。将冷冻干燥后的样品用PBS复溶，在T=10℃；t=20 min；V=18 000 r/min离心，取上清液定容至5ml，作为供试品B。

　　2.4.3  荧光测定取供试品A、B溶液，以水为空白，于Ex=490 nm；Em=510 nm波长处测定F值，并计算包封率。结果见表1及图2。
   
　　脂质体包封率（%）= （W总-W游）/ W总  × 100 %   
   
　　W总  ：药物投入量 ， W游：游离药物量

　　表1  包封率测定结果（略）

　　图2  冻干前后包封率变化图（略）
   
　　根据冻干前后包封率的比较可以得出：在样品包封率的提高和冻干保护方面：各保护剂在浓度高时均比浓度低时保护效果好。其中甘氨酸和甘露醇效果较好，二元保护剂中以蔗糖-甘氨酸，蔗糖-海藻糖两组的保护效果较好。山梨醇和二元保护剂蔗糖-甘露醇、蔗糖-山梨醇保护效果稍差。而以蔗糖、海藻糖和蔗糖-PVP保护剂效果最差。

　　2.5  冻干前后形态和粒径的变化冻干后外观：3，4，5，6号为白色，其余均呈黄色。取16个处方的冻干后脂质体用PBS复溶，用显微镜和数码图象分析软件对图象进行处理，测定粒径。结果见表2及图3。

　　表2  粒径测定结果（略）

　　图3  冻干前后粒径变化图（略）
   
　　根据样品冻干前后粒径的比较得出：大部分样品在冻干后平均粒径均增大，在样品粒径的冻干保护方面，冻干保护剂越好，冻干前后的粒径变化也应越小。从图上分析得：蔗糖，甘露醇和二元保护剂蔗糖-甘氨酸，蔗糖-山梨醇保护效果较好，甘氨酸，海藻糖，蔗糖-海藻糖，蔗糖-PVP保护效果次之，而山梨醇和蔗糖-甘露醇保护效果较差。

　　3   讨论
   
　　通过冻干前后脂质体包封率和粒径的比较，确定最佳冻干保护剂为甘露醇和二元保护剂蔗糖-甘氨酸，包封率达到69.91%和66.70%，比例分别为，甘露醇∶PC∶CH∶HB = 4∶1∶0.5∶0.2；蔗糖∶甘氨酸∶PC∶CH∶HB = 4∶0.8∶1∶0.5∶0.2。
   
　　冷冻干燥技术早期主要用于生物材料的保存，其原理是利用冷冻的溶液在低温低压条件下，从冻结状态不经过液态直接升华除去水分完成干燥。冷冻干燥技术可以使药物保持原有的理化性质和生理活性，且有效成分损失极少。此外，冻干制剂特有的疏松多孔结构，可以使药物易于重新复水而恢复活性，而且冻干制剂含水量低，易长期稳定保存。冻干制剂的低共熔态多孔结构在口腔内可迅速溶化释出药物，因此该技术现在也用于口服速溶制剂。
   
　　PVP属高分子冻干保护剂，在血细胞冻干的研究中经常用到。我们也曾尝试单独用PVP作保护剂，预实验过程中，当加入PVP后，PVP溶解性较差，溶液变得很粘稠，可能由于PVP黏附了部分荧光素，使得实验测得的荧光强度值偏小很多，由此计算所得的包封率也偏离实际水平，所以未采用PVP作保护剂。
   
　　【参考文献】
  　　［1］ 胡水根, 严惠芳,王奕军,等. 园背角无齿蚌有效成分脂质体抗小鼠肿瘤实验研究［J］.中国海洋药物,2003,94(4)：23.

　　［2］ van Winden EC,Crommelin DJ.Short term stability of freezedried,lyoprotected liposomes［J］.J Controlled Release,1999,58(1)：69.

　　［3］ 刘占杰.脂质体药物低温冷冻干燥的实验研究与机理分析［D］.上海：上海理工大学，2000.

　　［4］ van Winden EC，Zhang W,Cormmelin KJ.Effect of freezing rate on the stability of liposomes during freeze-drying and rehydration［J］.Pharm Res,1997,14(9)：1151.

　　［5］ 苏树强,华泽钊,丁志华,等. HB-Ⅰa冻干脂质体粒径及其分布的研究［J］.中国医药工业杂志,2004,35(3)：15.