决明子大黄素和大黄酚的提取与含量测定

amy54321 · 发表于 2014-8-17 21:12:57

【摘要】  目的比较研究提取决明子大黄素和大黄酚的不同方法。方法甲醇超声波、乙醇超声波、甲醇回流和乙醇回流分别提取决明子中的大黄素与大黄酚，高效液相色谱方法测定大黄素与大黄酚含量。结果甲醇超声波提取大黄素和大黄酚的效率最高。结论为决明子大黄素和大黄酚的提取与开发提供了参考价值。

【关键词】  决明子高效液相色谱提取方法

　　Extraction and Determination of Emodin and Chrysophanol Contents in Semen Cassiae.

　　Abstract：ObjectiveTo compare and research on various methods for extraction of emodin and chrysophanol from Semen Cassiae.MethodsThe emodin and chrysophanol were extracted by methanol or ethanol by means of ultrasonic or refluxing respectively. The emodin and chrysophanol contents were determined by RPHPLC methods.ResultsUltrasonic with methanol was the best extracting method for both emodin and chrysophanol. ConclusionThis method is meaningful for extraction and exploration of emodin and chrysophanol contents in Semen Cassiae.

　　Key words：Semen Cassiae; HPLC; Methods of extraction

决明子（Semen Cassiae）为豆科植物决明Cassia obtusifolia L.或小决明Cassia tora L.的干燥成熟种子，含有多种营养保健和药用成分，具有降血压、降血脂、保肝和抑菌等功效，其主要有效成分为蒽醌类化合物（大黄素、大黄酚等）［1］。由于决明子中大黄素、大黄酚的含量很低，如何提高其提取效率成为中药研究的重点和难点。2005版《中国药典》［2］中采用的是甲醇回流法，但是甲醇有较强的毒性，极易渗透进入皮肤对人体造成危害。考虑到大黄素和大黄酚均为极性分子，因此能否利用安全性更高和成本更低廉的乙醇来替代甲醇值得研究。回流提取决明子是常用的方法［3～5］，但是大量有机溶剂的使用会导致环境污染，成本增加，有机溶剂残留等问题。相比较而言，超声波提取作为提取工艺的新兴技术，其应用范围因其高效、绿色、廉价、操作简单而越来越广［6］。若能用超声波提取决明子大黄素和大黄酚，将非常值得推广。本文利用反相高效液相色谱（RPHPLC）方法，比较了甲醇、乙醇分别采用超声波、回流方法提取决明子大黄素和大黄酚的结果。现报告如下。

　　1  仪器与材料

岛津高效液相色谱系统：ODSC18色谱柱，LC6AD泵，SPDM10AVP紫外检测器，Shidamzu色谱工作站；FA1004电子天平（上海天平）；Beckman高速冷冻离心机；Millipore超纯水制备器和0.45 μm滤膜；KQ2200DB超声波；DHG9240A恒温干燥箱；决明子药材购于峨眉山市医药公司，并经西南交通大学药学院宋良科教授鉴定为豆科植物小决明（Cassia tora L.）的干燥成熟种子；大黄酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号110796200514）；大黄素对照品（中国药品生物制品检定所，批号110756200110）；甲醇为色谱纯；其余试剂均为国产分析纯。

　　2  色谱条件

　　2.1 色谱条件色谱柱为ODSC18 (250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇0.1%磷酸溶液（85:15）；流速1.0 ml/min；检测波长254 nm；柱温：25℃。以大黄素和大黄酚色谱峰计算，保留时间分别为12.55和16.16 min，理论塔板数不低于3 000。

　　2.2 标准曲线分别精密称取大黄素和大黄酚各2.5 mg，分别置于25 ml容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，配制成浓度均为0.1 mg/ml的大黄素和大黄酚贮备液。分别精密量取大黄素和大黄酚贮备液适量，置同一10 ml量瓶中，加甲醇稀释成不同浓度的系列混合对照品溶液。用微量注射器吸取20 μl不同浓度的混合对照品溶液，进行液相色谱分析，测定峰面积值。以峰面积积分值X为横坐标，进样量Y为纵坐标，进行线性回归。结果大黄素和大黄酚的直线回归方程分别为Y=－0.005 992 31＋1.617 93×10-7X，r＝0.999 5，线性范围0.02～0.4 μg；Y＝－0.002 782 31＋1.480 56×10-7X，r＝0.999 6，线性范围0.04～0.8 μg。　　2.3 供试品溶液的制备

　　2.3.1 超声波提取取粉碎过4号筛的决明子粉末，精密称定，置100 ml带塞锥形瓶中。加入甲醇（乙醇）25 ml，超声波提取30 min，冷却，用甲醇（乙醇）补足减失的重量。高速离心（8 000 r/min，15 min)，取5 ml上清，置50 ml圆底烧瓶中，挥去甲醇（乙醇），加2.5 mol/L硫酸液10 ml，超声处理5 min。再加氯仿10 ml，加热回流60 min，冷却，置分液漏斗分取氯仿层，氯仿液移至100 ml锥形瓶中，置水浴上挥去氯仿。残渣精密加甲醇10 ml，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，备用。高效液相色谱见图1。

　　2.3.2  回流提取取粉碎过4号筛的决明子粉末，精密称定，置50 ml带塞锥形瓶中。加入甲醇（乙醇）25 ml，70℃回流30 min，冷却，用甲醇（乙醇）补足减失的重量。后续步骤同超声波提取。高效液相色谱见图1。

　　2.4 精密度实验精密吸取每毫升含4 μg大黄素和8 μg大黄酚的混合对照品溶液20 μl注入液相色谱仪，测定峰面积，重复5次，大黄素峰面积的RSD值为1.66%，大黄酚峰面积的RSD值为1.51%。

　　2.5 稳定性实验精密吸取每毫升含4 μg大黄素和8 μg大黄酚的混合对照品溶液20 μl，分别于0，1 ，2 ，4 h和6 h注入液相色谱仪，测定大黄素峰面积的RSD值为1.73%，大黄酚峰面积的RSD＝1.57%。

　　2.6 加样回收率实验精密称取已知含量的决明子细粉0.1 g，加入大黄酚0.25 mg。按甲醇超声波方法制备，并按上述色谱条件测定，计算回收率。测得大黄酚的平均回收率为98.1%，RSD＝1.95%。表1  不同溶剂、不同提取方式提取决明子大黄素和大黄酚的含量（略）

　　3  讨论

分别以甲醇、乙醇作为溶剂，提取结果表明甲醇的提取效率要远超过乙醇；比较提取物中大黄酚和大黄素的比例，发现回流方法对大黄酚的提取相对较佳，而超声波方法则对大黄素的提取相对较易；在甲醇超声波提取30 min后，供试品溶液中大黄素和大黄酚的含量达到了最高：大黄素0.029%，大黄酚0.19%。2005版《中国药典》规定，决明子中大黄酚含量不得低于0.08%。以甲醇为溶剂，提取的大黄酚含量均超过0.08%，说明川产决明子品质是优良的。

分析甲醇提取优于乙醇提取的原因，有几方面：（1）大黄素和大黄酚的分子结构中都有数量不等的羟基。由于甲醇的分子量小于乙醇，而密度与乙醇相当，导致单位体积的甲醇分子数目远超过乙醇，以致与大黄素，大黄酚形成氢键的能力更强。氢键的增溶效应使得大黄素、大黄酚更易溶解于甲醇；（2）甲醇穿透植物细胞壁的能力比乙醇强，粘度比乙醇小，溶出的大黄素、大黄酚更易扩散开，形成更大的浓度差；（3）甲醇极性强于乙醇，更易提取出极性更强的糖苷型大黄素、大黄酚，经酸水解后，产生出更多的游离大黄素、大黄酚。

由于甲醇超声波提取的有效成分含量高，所需器材较少、操作简单，更为省时省力，因此建议在决明子质量控制中采用甲醇超声波代替甲醇回流法。采用本文中的色谱条件，大黄素、大黄酚与其它组分分离度好，重现性好，精密度好，回收率高，本实验结果可为决明子质量控制提供参考。

【参考文献】
  　　［1］郝延军，桑育黎，赵余庆. 决明子的研究进展［J］.中草药, 2001, 32(9): 858.

　　［2］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：98.

　　［3］刘芳，陈建伟. HPLC测定炒决明子中总大黄酚的含量［J］.中成药, 2005, 27(5)：549.

　　［4］戚爱隶，阎雪梅，王虹. 液相色谱法测定决明子中大黄酚的含量［J］.天津中医学院学报, 2002, 21(3)：49.

　　［5］王海堂，吕本莲，尹卫平，等. 正交实验法研究决明子提取工艺［J］.天然产物研究与开发, 2003, 15(2)：141.

　　［6］郭孝武. 超声技术在中草药成分提取中的应用［J］.中草药. 1996, 27(增刊)：234.

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