淮山药多糖的免疫调节作用研究

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       作者：徐增莱，汪琼，赵猛，徐琴，贾成森，史云云

【摘要】  目的探讨淮山药粗多糖对小鼠的免疫调节作用。方法小鼠灌胃给予不同剂量（200，400和800 mg/kg）的淮山药多糖，1次/d，连续8 d，进行ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验（MTT法）、测定血清溶血素测定（半数溶血值法）、小鼠碳廓清实验。结果山药多糖具有增强小鼠淋巴细胞增殖能力的作用，促进小鼠抗体生成的作用和增强小鼠碳廓清能力的作用。结论淮山药多糖具有一定的免疫功能增强作用。

【关键词】  淮山药；多糖；免疫调节

　　Abstract：ObjectiveTo investigate the immunologic enhancement of Dioscorea opposita Thunb.polysaccharide.MethodsDioscorea opposita Thunb.polysaccharide in different dosages(200,400,800 mg/kg)were given by IG for 8 d.A series of tests were carried out,such as the spleen lymph cells transformation of Con A inducing method (MTT method),hemolytic test of blood serum and hem chrome and mouse carbon test.ResultsThe results showed that Dioscorea opposita  Thunb.polysaccharide was significant to Con A induced mice Lymphocyte transformation test；HC50 raised in all three concentrations;ratio of monocyte-macrophage carbon grain elimination has significant changes to the control.ConclusionDioscored opposita Thunb.polysaccharide possesses a potential effect of immune regulation.

　　Key words：Dioscorea opposita Thunb.;  Polysaccharide;  Immunity moderation

    山药属常用中药，味甘、性平，具有补脾养胃、生津益肺、补肾涩精等作用。山药多糖Dioscorea opposita Thunb.polysaccharide是从山药中分离提纯的水溶性多糖成分，具有免疫调节作用。以往有关山药的药理研究多针对河南省出产的铁棍山药和太谷山药等怀山药品种。而山药在全国大部分地区均有栽培，淮山药为其在淮河中下游地区（江苏、安徽两省北部）传统栽培品种。以食用为主，兼作药用。对淮山药等山药地方品种的药理作用至今仍缺乏研究。为了充分利用淮山药资源，本实验研究了江苏产淮山药粗多糖对小鼠的免疫调节作用。

　　1  材料

　　1.1  样品淮山药Disoscorea oppostita Thunb.来源：淮山药采自江苏省灌南县花苑乡。

    将淮山药削皮切片，晒干后粉碎，干燥后称取粗粉（60目）900.0 g，加入适量蒸馏水在水浴中浸提，其间不断搅拌，静置冷却后离心（3 000 r/min，5 min）除去不溶物，收集上清液，减压浓缩。在冷却后的上清液中加入95%乙醇至醇含量在80%以上，不断搅拌，有大量沉淀生成，离心，收集沉淀，分别用无水甲醇和乙醚洗涤，以除去水分和杂质，得到灰白色粉末状粗多糖38.88 g(1 g粉末相当于生药23.14 g)。粗多糖得率可以达到4.32%，该粗多糖中含有18.43% 的山药多糖。

　　1.2  动物和细胞ICR种小鼠18～22 g，雄性，中国科学院上海克莱斯实验动物中心，合格证号：SCXK（沪）2003-2004。豚鼠，由江宁青龙动物养殖场提供，动物使用许可证号：（苏）2002-0057。所有实验动物均食用全价颗粒饲料，自由摄食饮水。YAC-1细胞，由南京中医药大学海洋中心药理毒理室提供。

　　1.3  绵羊红细胞（SRBC）与补体制备健康绵羊颈脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中朝一个方向摇动，以脱纤维，用阿氏液保存于4℃冰箱保存备用。用时生理盐水2000 r/min离心10 min洗涤3遍。

    采集豚鼠血，分离出血清（至少5只豚鼠的混合血清），前将1 ml压积SRBC加入到5 ml豚鼠血清中，放4℃冰箱30 min，经常振荡，离心取上清，分装小瓶，-70℃保存。用时以生理盐水按1∶10稀释。

　　2  方法

    小鼠随机分为对照组（给予蒸馏水）及山药多糖200，400，800 mg/kg［1］ 3个剂量组，每组10只。灌胃体积0.1 ml/10 g体重，1次/d，连续8 d。

　　2.1  C onA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验1640培养液用微孔滤膜过滤除菌，加入10%小牛血清、1%谷氨酰胺（200 mg/ml）、青霉素（100 mg/ml）、链霉素（100 mg/ml）及2-巯基乙醇（5 μmol/ml），用无菌HC1（1 mol/L）或无菌NaOH（1 mol/L）调pH至7.0～7.2，制成完全培养液；用7.2～7.4的PBS缓冲液作溶剂，现用现配MTT溶液（5 mg/ml）；以3.5%的无菌NaHCO3将无菌Hansks液pH调至7.2～7.4；用双蒸水配制成100 μg/ml的ConA液，过滤除菌后，-20℃保存；在96 ml异丙醇中加入4 ml HCl（1 mol/L）制成酸性异丙醇溶液。各组动物连续灌胃至第8天，每鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用摄子轻轻将脾撕碎，制成单个细胞悬液，200目过滤，用Hanks液多次洗涤、离心后悬浮于2 ml完全培养液中，用台酚染色计活细胞，调整细胞浓度为2×106个/ml，分两孔放入培养孔中，每孔1 ml，一孔加50 μl ConA液，另一孔作为对照，置5%CO2，37℃培养72 h，培养结束前4 h，每孔轻轻吸去上清液0.7 ml，加入0.7 ml不含小牛血清的1640培养液，同时加入50 mlMTT液，继续培养4 h。培养结束，每孔加入1 ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，移入1 ml比色杯中，于分光光度计，570 nm处测定光密度［2］。　　2.2  血清溶血素测定—半数溶血值（HC50）的测定各组动物连续灌胃至3 d时，每鼠腹腔注射2%（v/v）绵羊红细胞悬液0.2 ml。5 d（期间不停止灌胃）后，小鼠经眼眶取血于离心管中，放置1 h，3 500 r/min离心15 min，收集血清，血清用生理盐水缓冲液稀释320倍。将稀释后血清1 ml置试管内，依次加入10%（v/v）SRBC 0.5 ml，补体1 ml（用生理盐水按1∶10稀释），另设不加血清的对照管（以生理盐水代替）。置37℃恒温水浴中保温30 min后，冰浴终止反应。2 000 r/min离心10 min。取上清液1 ml，都氏试剂3 ml于试管内，同时取10%（v/v）SRBC 0.25 ml加都氏试剂至4 ml，于另一支试管内，作为SRBC的半数溶血值。充分混匀，放置10 min后，于540 nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值［2］。溶血素的量以半数溶血值（HC50）表示，按下列公式计算：
  各小鼠的半数溶血值（HC50）=样品管光密度SRBC半数溶血时的光密度×稀释倍数

　　2.3  小鼠碳廓清实验将印度墨汁用生理盐水稀释4倍制成用墨汁，称取1.0 gNa2CO3加蒸馏水至1 000 ml配置成0.1%Na2CO3溶液。各组动物连续灌胃至8 d时，每鼠尾静脉注入注射用墨汁（0.1 ml/10 g·bw），注入后立即计时，于注入后0.5 ，6 min分别从内眦静脉丛取血20 μl，加到2 ml Na2CO3溶液中，用分光光度仪计在600 nm波长处测光密度值，以Na2CO3溶液作为空白对照。颈椎脱臼处死小鼠，取肝脏、脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重［3］。按下列公式计算廓清指数K：

    廓清指数K=（logOD50-logOD6）/(t6-t0.5)

　　2.4  数据统计计量资料用（±s)表示，各组间实验数据的比较采用两样本均数t 检验，P＜0.05有显著差异。

　　3  结果

　　3.1  ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验（MTT法）用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力。结果如下。表1  淮山药多糖对小鼠淋巴细胞增殖能力的影响(略)

    以上结果表明山药多糖400，800 mg/kg剂量时，具有增强小鼠淋巴细胞增殖的能力的作用。

　　3.2  血清溶血素的测定实验（HC50法）结果见表3。表3  淮山药多糖对小鼠血清溶血素的影响(略)

    以上结果表明淮山药多糖各剂量都具有促进小鼠抗体生成的作用。

　　3.3  小鼠碳廓清实验结果见表4。表4  淮山药多糖对小鼠碳廓能力的影响(略)

    以上结果表明淮山药多糖800 mg/kg剂量时，具有增强小鼠碳廓清能力的作用。

　　4  讨论

    本研究测定了淮山药粗多糖对小鼠免疫功能的影响。结果显示淮山药粗多糖对能增强小鼠淋巴细胞增殖能力、促进小鼠抗体生成、增强小鼠碳廓清能力等作用。结果表明淮山药多糖对小鼠体液免疫、细胞免疫功能、非特异性免疫功能都有增强作用，具有一定的开发价值。

【参考文献】
  　　［1］中华人民共和国卫生部.保健食品功能学评价程序和检验方法规范［S］.2003：22.

　　［2］陈 奇.中药药理研究方法学［M］.北京：人民卫生出版社，1994：708，747.

　　［3］靳菊情，石 娟，葛 萍，等.长松萝多糖对小鼠免疫功能的影响［J］.中国药学杂志，2003，38（6）：431.