柱层析—分光光度法测定益母草中总黄酮含量

amy54321 · 发表于 2014-8-16 23:09:44

   作者：余丹妮，徐德生，冯怡，卫洪昌

【摘要】  目的建立益母草药材总黄酮含量测定方法，并对药材资源进行初步考察。方法以芦丁为对照品，样品经聚酰胺柱分离纯化，三氯化铝试剂显色后，采用紫外分光光度法在412 nm波长处测定总黄酮含量。结果芦丁在4.8～29.0 μg/ml范围内与吸光度有良好线性关系，r=0.999 6，平均回收率为102%，RSD=3%。结论该方法操作简单、准确，可作为益母草药材的质量分析方法。

【关键词】  益母草；总黄酮；柱层析—分光光度法

　　Abstract：ObjectiveTo establish the method for the quantitative determination of total flavonoids in Herba Leonuri, make the prime examination of the resources.MethodsThe sample was treated with a polyamide column for separation and purification ,and was colorated with aluminium trichloride ,and then,the content of flavone in the sample was determined at the wavelength of 412 nm by ultraviolet spectrophotometer with rutin as control.ResultsIt showed a good linear relationship in the range of 4.8～29.0 μg/ml，r=0.9996 the average recovery of the added sample was 102% and RSD was 3% .ConclusionThe method is simple and accurate. It can be used for the quality control.

　　Key words：Herba Leonuri;  Total flavonoids;  Column chromatogram UV spectrophotometry

益母草为唇形科益母草属植物Leonurous heterophyllus Sweet的干燥地上部分，性味苦、辛、微寒，归肝、心包经，具有活血化淤、利尿消肿的功效［1］。主要含生物碱、二萜、环烯醚萜苷、黄酮、有机酸等成分［2］。《中国药典》以生物碱作为益母草药材的含量测定指标。近几年来，黄酮成分开始受到专家和学者的关注。益母草中含有多种黄酮，如芦丁、槲皮素、山柰素及苷，洋芹素、芫花素及苷等［3］，研究表明益母草黄酮在心血管方面药理作用显著［4］。益母草药材和制剂中总黄酮含量测定报道不多，绝大部分是药材经初步提取后直接测定，половдмидр首次将柱层析引入益母草药材和制剂的含量分析［5］。目前，益母草总黄酮含量测定仍存在较大不足，如提取、除杂方式选择混乱导致测定干扰成分较多、显色方法选择缺乏依据等等，同时未见益母草药材中总黄酮资源的报道。本实验通过薄层色谱模拟柱层析条件，确定了药材的除杂方式，对益母草药材总黄酮含量测定方法进行了系统考察，并测定了6个地区益母草药材的总黄酮含量。

　　1  仪器与试药

Aglient8453紫外可见分光分析仪，752-N型分光光度计（上海分析仪器厂），BP211D sartorius电子天平。

益母草（6个产地药材分别购自上海康桥中药饮片有限公司、齐齐哈尔市百合中药饮片加工有限责任公司、河南光山县药材公司、广州市健和中药饮片有限公司、安徽亳州药材市场、广东市药材市场，经上海中医药大学生药教研室周秀佳老师鉴定均为唇形科植物益母草Leonurus heterophyllus Sweet）。

芦丁、槲皮素、山柰素对照品（均购自上海标准化中心）；聚酰胺薄膜、柱层析用聚酰胺80～100目（浙江台州市路桥四青生化材料厂产品）；甲醇、无水乙醇、氯化铝、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸均为分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  显色方法的选择亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠和三氯化铝为总黄酮测定中最常用的显色剂［6，7］。前者显色后测定波长为510 nm左右，后者在410 nm或270 nm附近。因益母草药材在500 nm处有较多的干扰吸收，且样品溶液中存在的槲皮素、山柰素等黄酮成分，以亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色后在500 nm处吸收较弱或无吸收［8］，因此，采用亚硝酸钠—硝酸铝—氢氧化钠做显色剂并不理想。所以选择三氯化铝为显色剂，芦丁为对照品，进行总黄酮含量测定。

　　2.2  除杂条件的确定取益母草药材适量，置索氏提取器中，加三氯甲烷回流提取至提取液无色，三氯甲烷液蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解为供试品溶液A。药渣挥去三氯甲烷，加甲醇继续提取至无色，提取液蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解为供试品溶液B。将以上样品及相应对照品溶液分别点样于聚酰胺薄膜上，先以水展开，水展开后将薄膜取出晾干，再以不同浓度乙醇展开，展开后的聚酰胺薄膜喷以三氯化铝试液，于365 nm紫外灯下观察荧光。薄层色谱图见图1～3。

薄层预示说明，聚酰胺吸附可去除叶绿素（供试液A部分）。水洗脱和20%乙醇洗脱可去除具有显色干扰的水溶性成分。70%乙醇洗脱可富集总黄酮。

　　2.3  药材总黄酮提取方法的比较分别取药材细粉3 g，加入甲醇50 ml，以回流（45 min），索氏提取（至无色），超声（200 w,59 kHz，45 min）3种方法进行提取，测定吸光度，计算总黄酮得率。结果提取方式选择回流提取。

　　2.4  益母草药材中总黄酮的测定

　　2.4.1  对照品溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的芦丁标准品0.002 5 g置25 ml容量瓶中，加60%乙醇溶解定容成0.1 mg/ml的溶液，即得。

　　2.4.2  供试品溶液的制备取药材细粉3 g，精密称定。置圆底烧瓶中，精密加入甲醇60 ml，称重，加热回流45 min，放冷、静置，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液30 ml置蒸发皿中，水浴蒸干。残渣加少量50%乙醇溶解，水浴挥去1/3体积，加蒸馏水至原体积，混悬，将混悬液过聚酰胺柱（80～100目，1 g，内径1 cm，湿法装柱）。以20 ml水冲洗，弃去水液，再以20%乙醇15 ml冲洗，并去醇液。最后，以70%乙醇洗脱，检视黄酮类黄色色带的移动，当色带到达下部时收集洗脱液，将洗脱液收集入25 ml容量瓶中，收集至近刻度，加50%乙醇定容，摇匀，作为供试品溶液。

　　2.4.3  测定波长的选择取对照品及供试品溶液适量，加入0.1 mol/L AlCl3溶液1 ml显色30 min后在200～800 nm进行波长扫描，扫描结果见图4。

结果表明，芦丁对照品及样品在273 nm处均有最大吸收峰，在412 nm处，芦丁有最大吸收，样品吸收强却不显示为最大吸收峰。实验中发现，经聚酰胺除杂后273 nm处干扰仍然显著。因此选择412 nm为测定波长。

　　2.4.4  线性关系考察精密吸取上述对照品溶液0，0.5，1，1.5，2，2.5，3 ml分别置于10 ml量瓶中，加0.1 mol/L AlCl3溶液1 ml，以60%乙醇定容至刻度，放置25 min，以1号样品为空白，412 nm处测定吸收值。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。计算得回归方程为Y=25.089X+0.0153，r=0.999 6，表明对照品在浓度范围4.8～29.0 μg/ml与吸光度有良好线性关系。

　　2.4.5  精密度实验取一定浓度供试品溶液测定吸光度，连续测定5次，其RSD为0.26%，仪器精密度良好。

　　2.4.6  稳定性实验取供试品溶液于室温分别放置5，10，15，20，25，30，35，45，55，65，75，85 min测定吸光度，供试品溶液放置25 min以后显色完全，且1 h内稳定，RSD为0.15%。2.4.7  重现性实验精密称取同批样品5份，按含量测定方法进行测定，总黄酮含量平均值为3.25 mg。RSD为1.4%，重现性良好。

　　2.4.8  加样回收率实验精密称取已知含量的益母草药材细粉5份，分别精密加入芦丁对照品适量，按含量测定项下方法进行测定，平均回收率为102%,RSD为3%。

　　2.4.9  样品含量测定取6个不同产地的益母草药材细粉适量，按照标准曲线项下方法在412 nm处测定吸光度。计算药材中黄酮含量。结果见表1。表1  6个地区益母草样本含量测定结果（略）

结果表明，黑龙江产益母草总黄酮含量最高，为3.27 mg/g；广西产益母草总黄酮含量最低，为0.7 mg/g。提示益母草中有效部位含量与地域、种属、采摘季节等因素有着密切的联系。

　　3  讨论

　　3.1  聚酰胺薄层预试与药材聚酰胺柱分离结果吻合，实验通过薄层考察了10%，20%，30%乙醇除杂效果，以20%乙醇为最好，洗脱选用60%，70%，80%乙醇进行比较，70%洗脱杂质少，且洗脱剂用量较小，因此，确定以70%乙醇洗脱总黄酮，洗脱用水和乙醇用量均以洗脱液薄层分析确定。

　　3.2  关于药材和提取物中总黄酮的含量测定国内报道一直较为混乱，各药材所含黄酮种类不一，在对照品、除杂方式、检测方法等方面应有所选择［9，10］，本实验以聚酰胺精制，除去大量干扰物质，使测定结果更趋合理，此方法可用于益母草药材及总提取物的含量测定。

　　3.3  实验中曾对不同的含量测定方法进行比较，以亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色比以三氯化铝显色测定结果偏高。不同的除杂方式对测定结果也有影响，与氯仿除杂相比，经聚酰胺柱除杂后测得的结果较低。因此，除杂方法和含量测定方法的选择在分光光度法测定总黄酮含量的过程中至关重要。

【参考文献】
  　　［1］国家药典委员会.中国药典［S］.北京：化学工业出版社，2005：V011.

　　［2］Zhang Xian,Peng Guoping. Studies on the chemical constituents of leonurus heterophyllus sweet［J］.Natural Product Reacher And Development(天然产物研究与开发)，2003 vol.15 No.2 104.

　　［3］Records of Chinese Traditional Medicine(New Edition)（新编中药志），vol.6 264.

　　［4］Zhang Bao Kang， Hu Yuan liang， Liu Jia guo， et al. A study on quality control method of NFPL［J］.Chinese Journal of Veterinary Drug(中国兽药杂志),2000，34（1）：17.

　　［5］половдмидр. Quantity control in the leonurus heterophyllus sweet material or product by UV spectrohotomatry［J］.Word PlantMedcine(国外医药·植物药分册),1993，8（5）：216.

　　［6］Liu Han qing, Tang Ren mao, Mo Fei et al. Research into quality for Xiaojianxhixue Granule［J］.J Nanjing University of traditional medicine and for Nat Sci.2005，16（5）：398.

　　［7］Huang Suo-yi，Li hai-ni，YuMei-liao et Extraction and Distin2uishin2of the Total Flavone from Leonurus［J］.Lishizhen Medicine And Materia Medica Research（时珍国医国药）,2005，15（5）：398.

　　［8］Guo Y J，Fan L，Wang XQ,et al.Discussion about NaNO2AL(NO3)3NaOH colorimetry for determination of total flavonoids［J］.Chin J Pharm Anal（药物分析杂志），2002，22（2）：97.

　　［9］Liu Xiaorou ,Wang Gun-fang ,YanQi-xin Quantitative determination of Flavonoids in GBE in health food［J］.Sinece and Technology of Food Industry（食品工业科技）,2005，vol6 174.

　　［10］Yang Meihua,Lu Yanwei ，Kuang Yan wei et al. Quantitative determination of total flavonoids in Desmodium styracifolium by column chromatogram-UV spectrophotometry［J］.Chin Tradit Herb Drugs（中草药），2004，35（6）：668.

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