壳聚糖絮凝法精制红花水提液工艺的研究

amy54321

    作者：陈英，李永吉，程淑云，徐缓

【摘要】  目的优选壳聚糖精制红花水提液的工艺。方法采用L9（34）正交设计表，以羟基红花黄色素A得率为指标，应用高效液相色谱法测定含量，对壳聚糖精制红花工艺进行优化。结果最佳工艺为A3B2C1，即将药液浓缩至生药∶药液＝1∶6，壳聚糖加入量为0.4 ml/g生药，放置时间6 h。结论壳聚糖絮凝法澄清效果好，经济实用，可用于红花水提液的精制。

【关键词】  壳聚糖； 红花； 高效液相色谱法； 正交实验

　　Abstract：ObjectiveTo optimize refinement of Carthamus tinctorius L. by chitosan flocculation.MethodsApplying the L9（34）of orthogonal design and high performance liquid chromatography(HPLC), with the yield rate of hydroxy safflower yellow A. as the index. ResultsThe optimized condition was A3B2C1, which was that medicinal herb: physic liquor=1:6, the addition of chitosan was 0.4 ml/g medicinal herb, setting 6 hours.ConclusionChitosan flocculation method was effective and economic for the clarification and can be used in the refinement of Carthamus tinctorius L.

　　Key words：Chitosan;   Carthamus tinctorius L.;  HPLC;  Orthogonal design

    脑得生由三七、红花、葛根、川芎、山楂5 味中药材组成，其中红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L．的干燥花，现代药理研究表明，它对心血管系统有广泛而显著的作用，其中查耳酮苷类化合物——羟基红花黄色素A为其活血化淤作用的主要有效成分。采用传统精制工艺，需要消耗大量乙醇，生产成本高，且有效成分易损失，影响制剂的疗效［1］。为了在纯化过程中尽量保留浸出液的有效成分，采用正交设计法，以羟基红花黄色素A得率为指标对红花提取液精制工艺进行了研究，优选出壳聚糖絮凝法的最佳工艺。

　　1  仪器与试药

　　1.1  仪器

　　高效液相色谱仪（Waters2695/2996/Empower色谱系统）；电子分析天平(上海梅特勒-托利多公司)；恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；离心沉淀机（上海医用分析仪器厂）。

　　1.2  试药红花药材购于哈尔滨市医药药材公司，经黑龙江中医药大学生药教研室王振月教授鉴定为菊科植物红花Carthamus tinctorius L．的干燥花。

    对照品： 羟基红花黄色素A（中国药品生物制品检定所，批号：200301）；壳聚糖（上海伟康生物制品有限公司，型号XNJ-1）；甲醇为色谱纯；水为超纯水；其余试剂为分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1   羟基红花黄色素A含量测定［2］

　　2.1.1  色谱条件色谱柱：Kromasil C18（4.6 mm×200 mm,5 μm）；流动相：0.7%磷酸-甲醇-乙腈（75∶15∶10）；流速：1.0 ml/min；检测波长：403 nm；柱温：30 ℃。

　　2.1.2  对照品溶液的制备精密称定60℃减压干燥至恒重的羟基红花黄色素A对照品适量，加水溶解，使成0.078 mg/ml的溶液，备用。

　　2.1.3  样品溶液的制备精密吸取精制后的供试品溶液1 ml，用水定容至25 ml容量瓶，待含量测定用。　2.1.4  标准曲线取对照品溶液（0.078 mg/ml），通过系统全自动进样器，分别进样1，2，4，8，16 μl ,在上述色谱条件下,测得峰面积。以峰面积Y为纵坐标,对照品进样量X (μg) 为横坐标,绘制标准曲线。得回归方程: Y= 2.82×106X－2.53×104 ，r＝0.999 9(n = 5) 。线性范围为0.078～1.248 μg。

　　2.1.5  精密度实验精密吸取上述对照品溶液10 μl，连续进样5次，测定峰面积值的RSD为0.2%（n=5）。

　　2.1.6  重复性实验精密吸取同一供试品溶液10 μl，连续进样5次，测定峰面积值的RSD为0.4%（n=5）。

　　2.1.7  稳定性实验取同一供试品溶液10 μl，分别于0，2，4，8，12，24 h各进样1次，测定峰面积值的RSD为0.4%（n=6）。

　　2.1.8  加样回收率实验取已知含量的样品，精密加入对照品溶液，依法制成供试液,按标准曲线法进行测定，计算回收率，结果见表1。表1  加样回收率测定结果（略）

　　2.2  壳聚糖絮凝法精制工艺

　　2.2.1  壳聚糖溶液的制备称取1 g壳聚糖，溶于1％醋酸溶液100 ml，得到1％壳聚糖醋酸溶液，备用。

　　2.2.2  供试品溶液的制备取红花药材200 g，加适量水湿润1 h，药粉分次装入渗漉筒内，浸渍24 h，加至10倍体积水，以一定流速渗漉，收集渗漉液定容于2 000 ml容量瓶。从2 000 ml药材提取液中取27份，每份30 ml约含3 g生药，按正交实验设计表进行试验，50℃恒温水浴放置后，离心（4 000 r/min），取上清液过滤后，取适量体积分别测定含量及固形物量。

　　2.2.3  正交实验结合文献报道，对影响提取效果的主要因素药液浓缩比例、壳聚糖加入量及放置时间进行考察，每个因素选择三个水平进行实验，因素水平见表2。表2  因素水平（略）

    根据因素水平表，选择了L9（34）正交表，以羟基红花黄色素A得率为考察指标，实验结果及方差分析见表3～4。表3  正交实验设计及结果分析（略）表4  方差分析（略）

　　由直观分析及方差分析可知,影响精制效果的因素大小依次是A>B>C,且A，B，C均具显著性，最佳工艺为A3B2C1，即将药液浓缩至生药∶药液＝1∶6，壳聚糖加入量为0.4 ml/g生药，放置50 ℃恒温水浴6 h后离心过滤即得。经实验验证,按最佳精制工艺条件所得的红花黄色素A占固形物含量为3.43％，与正交实验表中（A3B2C1）精制工艺的得率基本一致。

　　3  讨论

    壳聚糖的作用机制是利用电荷和大分子的架桥作用，去除溶液中的不溶性颗粒和鞣质、蛋白质、树脂等杂质，得到澄清的溶液。

    壳聚糖絮凝法不需要任何特殊设备，应用方便，而且壳聚糖本身价格低廉。该工艺不会减少溶液中可溶性总固体物，能有效地提高有效成分的含量，保证制剂的疗效，而且制剂稳定性好，所以在中药水提液的精制工艺中有良好的应用前景。

【参考文献】
  　　［1］吴 琼，李三鸣，姜爱萍，等.壳聚糖絮凝法精制红景天提取液［J］.沈阳药科大学学报，2005，22（3）：220.

　　［2］李 颖，张 戈，郭美丽，等.红花药材及注射液中羟基黄色素A的含量测定［J］.第二军医大学学报，2002，26（5）：587.