原子力显微镜在观察肿瘤细胞方面的应用与前景

JZ041567

【摘  要】 原子力显微镜（AFM）是一种具有纳米级或亚纳米级分辨率，能对细胞的超微结构和机械性能进行精确成像的分析仪器。由于疾病的发生常导致细胞形态和其力学性能的改变，因此原子力显微镜近年来被广泛应用于临床医学领域，特别是观察肿瘤细胞的机械性能与超微结构方面，显示出其良好的应用前景。
【关键词】 原子力显微镜；细胞膜结构；肿瘤细胞
        医学的每一次进步都是与人类的健康和疾病密不可分的，1981 年G.binnig和Rohrer等利用隧道原理研制出了第一台扫描隧道显微镜，1986 年G.binnig[1] 通过改进STM（原子力显微镜）研制出第一台原子力显微镜,这样人们就可以更加深入的从微观世界来探究细胞结构，使AFM越来越多的应用于医学领域。
        1  原子力显微镜的介绍
        1.1  原子力显微镜的工作原理[2]
        原子力显微镜利用一个对微小作用力极为敏感探针的探测针尖与标本间的相互作用力来实现成像的。由于探针针尖原子与标本表面原子间存在极为微弱的排斥力，将一个相对微弱力敏感的弹性微悬臂固定，另一端有一微小针尖，同距离有关的针尖标本间相互作用力，会引起微悬臂的形状改变，形状改变量的大小可作为相互作用力的直接量度，由隧道电流检测法得到。当进行扫描时，反射到检测器的光电信号使系统保持标本与针尖作用力或距离的恒定，同时压电扫描器需随标本的形态变化不断调整Z轴的变化来记录每一点高度的改变，通过计算机系统的数据处理来获得标本的表面三维形貌信息。原子力显微镜的工作模式可分为两种：接触模式和轻敲模式。前者的特点是探针的针尖在扫描过程中始终会与标本直接接触，实现相对简单，但成像时针尖对样本的作用力较大，而后者针尖与标本之间接触是瞬时性的，能克服接触模式下因针尖的作用力引起的标本损伤。
        1.2  应用原子力显微镜观察的主要优势
        首先，可观察标本的范围广泛，样本可以是金属、半金属、半绝缘或是绝缘，并且多数细胞可直接用原子力显微镜直接扫描，标本制备时间短，不需提前处理，操作比较简便；其次，成像环境受影响较小，既可在真空中进行，也可在空气或液体中进行。由于可在液体中观察，使原子力显微镜可在生理条件下成像细胞，同时可高清晰度的记录标本分子结构变化的动力学过程，这是其它扫描电镜或投射电镜等所不具备的；再次，其高的分辨率，能比较客观的反映标本的原貌，横向分辨率最高可达0.1 nm，纵向分辨率也可达0.01 nm，均超过其他电镜的分辨能力，能从原子量级来观察细胞膜的变化；此外，其成像时间短，可以捕捉到一些快速反应过程，可得到及时准确的三维相貌图。因此，原子力显微镜为我们在纳米级超微结构上观察细胞膜提供了广阔的空间。
        2  肿瘤细胞中的应用与研究
        细胞是生物体形态结构和生命活动的基本单元，目前人们对于肿瘤细胞的研究还不够深刻，利用原子力显微镜来观察肿瘤细胞，利用所测得的三维相貌图将肿瘤细胞和正常细胞进行比较，可以比较直观的观察它们之间存在的细胞膜的异同，为进一步研究肿瘤的病因及发生机制、诊断等提供了一个新的途径。
        目前利用原子力显微镜研究肿瘤细胞有望在两个方面有所突破：①肿瘤的早期诊断，通过对细胞间的变化与差异的观察，以及肿瘤细胞与其它不同种类细胞间的关联，实现了在细胞水平上对肿瘤的早发现，早治疗[3]。②肿瘤的临床治疗，研究肿瘤细胞的结构和功能，探索肿瘤细胞的扩散、细胞间的相互作用以及药物对肿瘤细胞的作用机理等，寻找阻断和杀死肿瘤细胞的方法，使肿瘤不再成为不治之症。
        2.1  在肿瘤的早期诊断中的应用
        早期， Annalisa 等[4]较早地利用原子力显微镜比较了人正常神经细胞和神经肿瘤细胞表面的形态结构，原子力显微镜的观察图像是光学显微镜所不能及的，特别是神经元的突起，同时也比较了两种细胞在培养中受视黄酸作用细胞隔膜产生结构的变化。马枫茹等[5] 将原子力图像应用于人体黑素瘤，进行细胞膜表面超微结构的观察，对于相关肿瘤细胞的特性有了更直观的了解，为人类黑素瘤的早期和快速诊断提供实验依据。
        近年来，Ruchika[6]等利用原子力显微镜和扫描电子显微镜结合RT-PCR 和Western blotting 方法观察培养的人类胚胎肾细胞（HEK）293，人类乳腺癌（MCF-7）细胞株和鼠黑色素瘤（B16F1）细胞株。发现正常细胞表面光滑可能因为细胞膜表面SMAR1表达下降，而肿瘤细胞表面粗糙则是因为SMAR1 表达增加。Cross 等[7]利用原子力显微镜观察了从可疑肺癌、乳腺癌和胰腺癌患者胸腔获得的活的转移性癌细胞的刚度，发现癌细胞的刚度变化是他们研究的新特点，这影响它们的传播方式，并应用力学数据分析正常细胞和癌变细胞的机械性能。这些结果表明，纳米力学分析与免疫组化检测的相关性很好，可用于肿瘤的早期诊断。
        卢育洪等[8]采用Ficoll密度梯度离心法得到人外周血单个核细胞，并结合磁珠分选的方法进一步纯化得到正常B淋巴细胞，探索了正常和肿瘤B淋巴细胞之间的差异。通过应用具有高分辨率的原子力显微镜对正常人和慢性淋巴白血病人外周血B淋巴细胞进行成像，并对这两种B淋巴细胞的高度、直径、体积及膜表面的颗粒平均高度、平均粗糙度和颗粒分布进行测量，对比观察两组细胞膜表面宏观和纳米结构的变化，实验证明应用AFM可在形态学和机械性质上明显区别正常和慢性淋巴白血病B淋巴细胞，为临床诊断慢性淋巴白血病提供新的技术手段。
        2.2  在肿瘤的临床治疗中的应用
        Braet等[9]较早利用原子力显微镜观察到肝脏的NK细胞（自然杀伤细胞）和CC531s大肠癌细胞在共同培养基相互作用以后，CC531s大肠癌细胞的数量明显减少，这就为临床治疗提供了一个新的思路，可以尝试利用自然杀伤细胞来杀伤肿瘤细胞。
        近期，王可人[10]等应用原子力显微镜观察不同浓度吡柔比星对MCF27乳腺癌细胞膜的影响，结果显示吡柔比星对乳腺癌细胞膜结构的作用主要为造成膜结构出现大量不等较深的孔洞(直径> 100 nm，深度> 20 nm)，因此可能造成细胞内外环境失衡继而死亡，且孔洞大小及深度随药物浓度及作用时间增加而增加，这为利用蒽环类药物治疗乳腺癌提出了指导意义。Cecchi 等[11]利用原子力显微镜在接触模式下，就人类SH-SY5Y 神经母细胞瘤中ADDLs 对膜脂质过量和胆固醇含量的依赖性进行了调查研究，对神经母细胞瘤的临床治疗提出了新的方法。
马丽娜等[12] 利用CCK-8法检测华蟾素对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制作用；用流式细胞术检测细胞的凋亡抑制率；利用倒置荧光显微镜观察细胞整体形态的变化；利用原子力显微镜高分辨率、高灵敏度的特点，从纳米尺度上进一步观察细胞形貌及超微结构的变化，结果提示，华蟾素对MCF-7 细胞的生长有明显的抑制作用，且随着剂量的增加(6.25～50 mg?L－1 )而增大，当浓度为50 mg?L－1时,抑制率达到(68.40±1.02)%，为华蟾素应用于乳腺癌的临床治疗提供新的依据。
   3  展望
        肿瘤目前仍然是危害人民健康的杀手，受到世界各国卫生机构的关注。据世界卫生组织估计，全世界肿瘤每年发病约为590 万人，死亡430 万，约占世界人口总死亡人口的10%。原子力显微镜的发明和应用为人类对于肿瘤细胞的研究提供了有力的工具，对肿瘤细胞的形貌[13-14]、表面粗糙度[15-16]、细胞粘弹性[17-18]及相关功能进行研究。由于病变与细胞的形态和力学的性质有关，利用原子力显微镜可以简便迅速的获取信息，因此非常适用于肿瘤的诊断和治疗当中[19-21]。虽然目前原子力显微镜仍存在着细胞纯度的提取，单细胞的获得及标本在溶液固定后活性减低等问题，但随着原子力显微镜技术的不断完善和进步，其在肿瘤早期诊断和临床治疗中将会显示出更大的应用前景。
参考文献
[1] Binnig G, Quate CF, Gerber C. Atomic force microscope[J].Phys Rev Lett, 1986,56(9):930-933.
[2] 顾树江,纪小龙. 观察细胞形态的新工具-原子力显微镜[J].中国实用医药,2008,3(9):136-137.
[3]马登军,孙汉文,袁倬斌,肖小玲,黄莉莉. 原子力显微镜在癌细胞观察和研究中的应用[J].华北科技学院学报,2006,3(4):50-56.
[4]Annalisa B,Maria T P, Gian P T. ExperimentalCell Re,1995,216(1):73.
[5]马枫茹,刘琨,张毅,潘石,吴世法.单个人体黑素瘤细胞的原子力显微图像及拉曼光谱的研究[J].电子显微学报,2007,26(1):55-59.
[6]Ruchika KG, Singh S, Mamgain H, et al. Tumor suppressor protein SMAR1 modulates the roughness of cell surface: combined AFM and SEM study[J]. BMC Cancer, 2009, 9: 350.
[7]Cross SE, Jin YS, Rao J, et al. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients［J］. Nat Nanotechnol, 2007, 2(12):780-3.
[8]王秋兰, 卢育洪, 李盛璞, 龚超群, 蔡继业. 利用原子力显微镜探测人正常与慢性淋巴白血病外周血B淋巴细胞[J].分析测试学报,2010,29(10):1005-1010.
[9]Braet F, Vermijlen C, Bossuyt V, et al. Early detection of cytotoxicevents between hepatic natural killer cells and colon carcinoma cellsas probed with the atomic force microscope[J]. Ultramicroscopy,2001,89(4):265-273.
[10]王可人, 宋燕, 叶玉琴, 续哲莉, 孙辉. 不同浓度吡柔比星对MCF27乳腺癌细胞膜影响的原子力显微镜观察[J].中国实验诊断学,2008,12(4):454-455.
[11]Cecchi C,Nichino D, Zampagni M, et al. A protective role for lipidraft cholesterol against amyloid-induced membrane damage in human neuroblastoma cells[J]. Biochim Biophys Acta,2009,1788(10):2204-2216.
[12]马丽娜,宋兵,金花,彭元,蔡继业.华蟾素对乳腺癌细胞株MCF-7的杀伤作用研究[J].2011,27(1):37-41.
[13]CRICENTI A, GENEROSI R, GIRASOLE M, SCARSELLIM A, PERFETTI P, BACH S, COLIZZI V. Atomic force microscopy observation of human lymphoid cells chronically infected with the human  immunode ficiency virus[J].J VacSciTechnolA, 1999,4(17):1141- 1144.
[14]KONDRA S, LAISHRAM J, BAN J, MIGLIOR INIE, DIFOGGIA V, LAZZARINO M, TORRE V, RUAROM E.Integration of confocal and atom ic force microscopy images[J]. JNeurosciMethods, 2009, 177( 1): 94-107.
[15]WANG JY, WAN ZF, LIU WM, LI L, REN L, WANG XQ, SUN P, REN LL, ZHAO HY, TU Q, ZHANG ZY, SONG N, ZHAN L. Atomic force microscope study of tumor cell membranes following treatment with anticancer drugs[J] . Biosensors Bioelectron, 2009, 25( 4): 721-727.
[16]KAUL-GHANEKAR R, SINGH S, MAMGAIN H, JALOTA-BADHWAR A, PAKNIKARK M, CHATTOPA DHYAY S. Tumor suppressor prote in SMAR1 modulates the roughness of cell surface: combined AFM and SEM study[J]. BMC Cancer, 2009, 9(1): 350.
[17]KUZNETSOVA T, STARODUBTSEVA M, YEGOREN KOV N, CHIZHIK S, ZHDANOV R. Atomic force microscopy probing of cell elasticity [J]. Micron, 2007, 38(8): 824-833.
[18]龚超群, 郜世隽, 蔡继业, 王秋兰. 重组质粒pIRES- EGFP- BCL 11B电转染幼稚T细胞的可视化研究[J]. 分析测试学报, 2009, 28(12):1389-1395.
[19]FARIA E, MA N, GAZI E, GARDNER P, BROWN M, CLARKE N W, SNOOK R D. Measurement of elastic properties of prostate cancer cells using AFM [J]. Analyst, 2008, 133(11): 1498- 1500.
[20]DULIN’SKA I, TARGOSZ M, STROJNY W, LEKKA M, CZUBA P, BALW IERZ W, SZYMON’SKIM. Stiffness of normal and pathological erythrocytes studied by means of atomic force microscopy[J]. J Biochem Biophys Methods, 2006,66(1/3): 1-11.
[21]蔡小芳,蔡继业,董世松,邓华,胡明铅. 应用原子力显微镜分析正常淋巴细胞和Jurkat细胞的形态和机械性质[ J].生物工程学报,2009,25(7): 1107-1112.