河南汉族人群eNOS基因27 bp VNTR, G894T多态性与深

JZ041567 · 发表于 2014-4-8 00:09:43

   作者：杨冬之贺颖于辉赵洛沙郑红

【摘要】  目的：探讨内皮细胞型一氧化氮合酶（eNOS）基因27 bp VNTR，G894T基因多态性与深静脉血栓形成（DVT）的相关关系. 方法：运用PCRRFLP方法对103例DVT患者和250例健康对照进行eNOS基因27 bp VNTR，G894T多态性的检测分析，并进行基因型频率及等位基因频率的比较以及单倍型分析. 结果： 4a/4a基因型频率的分布以及4a等位基因频率的分布在DVT组与对照组差异有统计学意义（P<0.05）；相对风险分析发现，携带4a等位基因的个体发生DVT的危险性增加；OR=1.950，95%CI为1.128～3.371. 4aG, 4bG两种单倍型组合在DVT组与对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.05）. 对eNOS基因4a/b和G894T做配对连锁不平衡检验，D′=0.681，r2=0.003. 结论：提示27 bp VNTR多态性与深静脉血栓形成相关，携带4a等位基因者可能具有易患静脉血栓的危险性；4aG可能是河南汉族人DVT发生的风险单倍型，而4bG可能对河南汉族人群DVT的发生具有某种保护作用. 4a/b和G894T 之间不具有连锁不平衡.
【关键词】  一氧化氮合酶基因多态性可变串联重复序列

　　0引言
　　深静脉血栓形成（deep venous thrombosis, DVT）的机制异常复杂，通常大型手术、骨折、肥胖、老龄、妊娠、口服避孕药等因素为其外在诱因，遗传性缺陷则是其形成的内在因素. 近年来，血栓遗传易感基因和遗传风险因子的研究成为该领域新的研究热点［1-2］. 一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）催化L精氨酸的氧化反应生成一氧化氮（nitric oxide，NO），NO可介导平滑肌细胞舒张，是调节血管张力的重要信使分子. 目前在哺乳动物中已经发现三种NOS的同工酶，分别为神经源型NOS(neuronal NOS,nNOS),诱导型NOS(inducible NOS, iNOS)和内皮细胞型NOS(endothelial NOS, eNOS)［3］. 有研究表明［4］内皮细胞型NOS基因（eNOS）存在基因多态性，其中第4内含子的一个27 bp的插入/缺失多态性以及第7外显子894位碱基GT的突变（G894T）可能影响eNOS蛋白的功能及活性，降低NO的生成量，加速动脉粥样硬化的发展，与血栓性疾病及心脑血管疾病密切相关. 我们应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism, PCRRFLP)方法对103例深静脉血栓形成（deep venous thrombosis, DVT）患者及250例正常对照进行eNOS基因27 bp数目可变的串联重复序列（variable number of tandem repeat, VNTR)和G894T基因多态性的检测，探讨这些遗传多态因子与深静脉血栓形成之间可能的相关性.
　　1对象和方法
　　1.1对象
　　经患者同意，选取200201/200211在郑州大学第一附属医院与河南中医学院第一附属医院门诊和住院的深静脉血栓形成（DVT）患者103(男65，女38)例,年龄（48.3±4.8）岁, 来自河南省不同地区. DVT诊断均经静脉造影确诊. 正常对照250(男142，女108)例,年龄（42.2±10.2）岁,为郑州血液中心的健康献血者. 经详细病史询问，体格检查及实验室检查均未见异常，并排除有心血管病、高血压或糖尿病家族史者. 本研究人群个体之间无血缘关系，均为河南汉族人群.
　　1.2方法
　　1.2.1DNA提取抽取DVT患者与正常对照
　　静脉血3 mL，EDTA抗凝，用常规酚/氯仿方法提取基因组DNA，其含量用紫外分光光度计测定.
　　1.2.2PCR扩增目的片段
　　27 bp VNTR引物参照Wang等［5］设计，由上海生工合成，其核苷酸序列为：引物forward: 5′AGG CCC TAT GGT AGT GCC TTT3′,  引物reverse: 5′TCT CTT AGT GCT GTG GTC AC 3′. G894T引物参照Hingorani等［6］设计forward: 5′CAT GAG GCT CAG CCC CAG AAC3′,  reverse: 5′AGT CAA TCC CTT TGG TGC TCAC 3′. PCR反应体系为25 μL,其中含PCR缓冲液2.5 μL,上下游引物各2 μL，样本DNA 1.5 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL (1 U)，加去离子水至25 μL. PCR扩增条件：95℃热启动5 min，95℃变性1 min, 59℃退火1 min, 72℃延伸1 min;共35个循环后，72℃延伸10 min后冷却至4℃.
　　1.2.3G894T PCR产物的酶切
　　取PCR扩增产物10 μL，加10×缓冲液2 μL，限制性内切酶BanII 5 U，加去离子水补至20 μL，37℃水浴24 h. 30 g/L琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，凝胶成像分析仪上观察并照相.
　　1.2.44a，4b等位基因的序列测定
　　为进一步证实结果的准确性，我们选取2例不同基因型的样本进行序列测定，由上海生工生物工程公司进行自动测序.
　　统计学处理:  数据资料运用SPSS10.0统计软件进行统计分析，对各组之间的基因型频率及等位基因频率的差异进行χ2检验，检验水准α=0.05. 并计算比数比(Odds Ratio,OR)及95％可信区间(CI),以估计基因突变对疾病发生的相对危险度. 单倍型频率计算以及连锁不平衡应用SHEsis软件［7］，连锁不平衡系数用D′=D/Dmax，D′>0.70有意义［8］.
　　2结果
　　2.1eNOS基因27 bp VNTR基因多态分型及测序内皮细胞型一氧化氮合酶基因型多态性表现为VNTR, 6次重复等位基因的PCR扩增片断长447 bp，包括27 bp序列重复6次（162 bp）和285 bp上下游侧翼序列，表示为eNOS4c；5次和4次重复等位基因的PCR产物分别为420 bp和393 bp，其中重复序列分别为135 bp（5个27 bp的重复序列）和108 bp(4个27 bp的重复序列)，分别表示为eNOS4b, eNOS4a. 图1所示为eNOS基因第4内含子VNTR的3种等位基因4种基因型.
　　序列测定结果证实27 bp的重复序列单元与以前报道结果一致［9］，VNTR的27 bp重复核心序列为［5′GAAGTCTAGACCTGCCTGCTGC(A/G) GGGGTGAG3′］. 核心序列中第19位碱基可以是A或G，5次重复等位基因中前3个为A，后2个为G；4次重复等位基因中前2个为A，后2个为G. 图2是有4次重复的碱基序列，方框内为重复序列.
　　2.2eNOS基因G894T基因多态分型
　　eNOS基因G894T PCR扩增目的片段大小207 bp. 根据酶切片段的结果，基因型有3种，即GG基因型（125 bp,82 bp）, GT基因型（207 bp,125 bp,82 bp）, TT基因型（207 bp）（图3）.
　　2.3eNOS基因27 bp VNTR基因多态在DVT组和对照组的比较
　　检测结果表明，DVT组与正常对照组eNOS基因27 bp VNTR均存在eNOS4a, eNOS4b两种等位基因，以及4a/4a纯合，4a/4b杂合，4b/4b纯合3种VNTR基因型. 此外，我们在对照组中发现一例罕见的4a/4c杂合基因型. DVT组与对照组4a/4a基因型频率的分布差异有统计学意义（P<0.05）, 4a等位基因频率的分布差异也具有统计学意义（P<0.05）. 携带4a等位基因的个体与正常对照相比，发生DVT的危险性增加，OR=1.950；95%CI为1.128～3.371（表1）.表1DVT组与对照组27 bp VNTR和G894T基因型频率和等位基因频率的比较（略）
　　2.4eNOS基因G894T基因多态在DVT组和对照组的比较
　　检测结果表明， eNOS基因G894T多态性共检测出三种基因型： GG, GT和TT. DVT组GG, GT和TT基因型频率分别为83.50%， 14.56%和1.94%；对照组的基因型频率分别为89.6％， 10.0％和0.4％；DVT组与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）. G, T等位基因频率在两组间差异也无统计学意义（P>0.05）. 相对风险分析发现，未见携带T等位基因的人发生静脉血栓的危险性增加，OR=1.780，95％的CI为(0.966～3.279)（表1）.
　　2.5eNOS基因4a/b和G894T两位点的单倍型分析及配对连锁不平衡检测
　　我们采用SHEsis软件计算单倍型频率，各种单倍型组合在DVT组与对照组相比，4aG, 4bG两种单倍型组合差异具有统计学意义（P<0.05）. 携带4aG单倍型的个体发生DVT的危险性增加， OR=1.835 （95%CI为1.054~3.198）；而携带4bG单倍型的个体发生DVT的危险性减少，OR＝0.532（95%CI为0.346~0.818）（表2）. 对eNOS基因4a/b和G894T做配对连锁不平衡检验，D′=0.681，r2=0.003，说明4a/b和G894T 之间不具有连锁不平衡.表2eNOS基因4a/b和G894T单倍型组合在DVT组和对照组的比较（略）
　　3讨论
　　NO是体内重要的抗动脉粥样硬化的分子，能抑制血小板、白细胞和单核细胞黏附到血管内皮，抑制血管平滑肌细胞的增殖、迁移. 另外，NO能松弛血管平滑肌、舒张血管，在血管紧张性的调节中起关键性作用. 生理状态下，血管内皮的功能依赖于内皮少量持续地产生NO来维持. eNOS通过“精氨酸NOS瓜氨酸”途经合成NO，eNOS是该途径中的惟一限速酶. eNOS基因突变可能影响eNOS蛋白的功能及活性，降低NO的合成，加速动脉粥样硬化的发展，从而引发血栓形成及心脑血管疾病［10］.
　　1996年Wang等［5］在澳大利亚白人中首次研究了eNOS基因27 bp VNTR多态性与CAD的关系. 结果显示，严重冠脉狭窄患者与轻微或无狭窄者相比,aa基因型频率显著增高,有心肌梗死(MI)患者aa基因型频率也显著高于无MI患者,提示27 bp VNTR多态性与吸烟依赖性CAD的发生有关,a等位基因使患CAD的风险和严重性增加. 我们的研究结果显示，DVT组与正常对照组eNOS基因27 bp VNTR均存在4次，5次重复序列，以及4a/4a纯合，4a/4b杂合，4b/4b纯合3种VNTR基因型，eNOS各基因型在人群中的分布以4b/4b 纯合子最多，其次是4a/4b 杂合子，4a/4a 基因型较少. 此外，我们在对照组中发现一例罕见的4a/4c杂合基因型. 4a/4a基因型频率以及4a等位基因频率明显高于正常对照组，携带4a等位基因的个体发生DVT的危险明显增加OR=1.950； 95%CI为1.128～3.371. 该结果提示，eNOS基因的27 bp VNTR基因多态性与深静脉血栓的形成具有相关性，携带4a等位基因的人具有易患静脉血栓的危险性.
　1993年Marsden等［11］首次报道在eNOS基因第7号外显子上894位碱基G突变成T(G894T),使第298位密码子序列由GAG变为GAT, 导致其编码的相应蛋白产物谷氨酸被替换成天冬氨酸(Glu298Asp). 该突变可能与血栓性疾病的发生密切相关. 我们共检测出eNOS基因G894T多态三种基因型，其中GG纯合子最多，其次是GT杂合子，TT基因型极少. GG，GT和TT基因型频率的分布在DVT组与对照组间差异无统计学意义，等位基因频率的分布差异无统计学意义. 携带T等位基因的人发生DVT的危险性并不增加OR=1.780，95％的CI为(0.966～3.279). 该研究结果提示eNOS基因G894T多态可能不是河南汉族人群深静脉血栓形成的独立危险因素，T等位基因可能不是河南汉族人静脉血栓形成的遗传性危险因子. 关于eNOS基因G894T与静脉血栓形成的相关关系，仍需更大的样本量进行更深入的研究.
　　我们对4a/bVNTR和G894T进行单倍型分析，主要形成4aG,4aT,4bG,4bT等4种单倍型组合，其中4aG, 4bG两种单倍型组合在DVT组与对照组之间差异具有统计学意义（P<0.05）. 携带4aG单倍型的个体发生DVT的危险性明显增加，OR=1.793 （95%CI为1.134~2.836）；而携带4bG单倍型的个体发生DVT的危险性明显减少，OR＝0.544（95%CI为0.381~0.775）.
　　上述结果提示4aG可能是河南汉族人冠心病发生的遗传风险因素，而4bG可能对河南汉族人群冠心病的发生具有某种保护作用. 对eNOS基因4a/b和G894T做配对连锁不平衡检验，D′=0.681，r2=0.003，说明4a/b和G894T 之间不具有连锁不平衡.
致谢本实验在河南省医学分子重点实验室完成.

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