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【摘要】 目的建立高效液相色谱法测定八角莲中鬼臼毒素含量的方法。方法采用高效液相色谱法,色谱柱为Diamonsiltm C18柱;流动相:甲醇-0.1 mol/L磷酸二氢钾水溶液(50∶50);流速:1.0 ml/min;检测波长:290 nm。结果 鬼臼毒素在0.047 69~0.476 9 mg/ml呈良好线性关系(r=0.999 6),平均回收率为99.94%,RSD=1.71%(n=5)。结论 采用高效液相色谱法测定八角莲中鬼臼毒素的含量,操作简便、准确,专属性强。
【关键词】 高效液相色谱 八角莲 鬼臼毒素
Abstract:ObjectiveTo establish a method of determining Podophllotoxin in Dysosma versipellis by HPLC.MethodsHigh Performance Liquid Chromatography was performed Diamonsil C18. The chromatography conditions were as follows: methanol - 0.1mol/L monobasic potassium phosphate (50∶50) as mobile phase, flow rate being 1.0ml/min and detecting wavelength was 290nm.ResultsA good linearity of Podophllotoxin was shown in range of 0.047 69~0.476 9 mg/ml (r=0.999 6), the average recovery was 99.94% and RSD was 1.71%(n=5). ConclusionThe method can supply evidence for the quality evaluation of Dysosma versipellis. It is simple and accurate.
Key words:HPLC; Dysosma versipellis; Podophllotoxin
八角莲为小檗科植物八角莲Dysosma versipellis(Hance.)M. cheng (Podophyllum versipelle Hance.)的根及根茎。具有清热解毒、化痰散结、祛痰消肿之功能。用于痈肿疔疮、瘰疬、咽喉肿痛、跌打损伤、毒蛇咬伤等。笔者曾对八角莲的性状、显微结构进行过研究[1]。本实验采用高效液相色谱法测定八角莲中鬼臼毒素的含量,为完善八角莲药材的质量标准及临床应用提供科学依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 戴安UltiMateTM3000型高效液相色谱仪,包括四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、变色龙(chromeleon)软件数据处理系统;岛津AUW120D分析天平(d=0.1mg/0.01 mg);UP5200H超声波清洗器(熊猫集团南京电子计量有限公司)。
1.2 试药 甲醇为色谱纯(中国上海陆都化学试剂厂);磷酸二氢钾为分析纯。鬼臼毒素对照品(含量测定用,以93.5%计,批号111645-200301)由中国药品生物制品检定所提供;八角莲Dysosma versipellis(Hance.)M. Cheng (Podophyllum versipelle Hance.),由中南民族大学万定荣教授鉴定和提供。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 Diamonsiltm C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为甲醇-0.1 mol/L磷酸二氢钾(50∶50);检测波长290 nm;流速1.0 ml/min;柱温30℃;灵敏度:0.1AUFS;理论塔板数按鬼臼毒素峰计算不低于1 500。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取在五氧化二磷干燥器中减压干燥12 h的鬼臼毒素对照品适量,加甲醇制成每毫升约含0.5 mg的溶液,摇匀,微孔滤膜过滤(0.45 μm),得鬼臼毒素对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备 分别取八角莲根茎和根粉末(过3号筛)各约0.5 g,精密称取,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25 ml,密塞,放置12 h,称定重量,超声处理30 min,取出,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,微孔滤膜过滤(0.45 μm),得八角莲根茎和根的供试品溶液。
2.4 八角莲根茎和根HPLC谱图比较 分别取八角莲根茎和根供试品溶液10 μl,注入高效液相色谱仪中,对其HPLC图进行比较,由图1~4比较可以看出,八角莲根中基本不含鬼臼毒素成分。
图1 八角莲根茎HPLC图(略)
图2 八角莲根HPLC图(略)
图3 鬼臼毒素对照品HPLC图(略)
图4 空白溶剂HPLC图(略)
2.5 线性关系考察 精密称取在五氧化二磷干燥器中减压干燥12 h的鬼臼毒素对照品25.5 mg,置50 ml容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀(0.51×93.5%=0.476 9 mg/ml),精密量取溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 ml,分别置10 ml容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,按上述色谱条件测定峰面积,以峰面积为纵坐标,鬼臼毒素含量为横坐标,绘制标准曲线,统计学计算回归方程为:Y=0.011 08X+8.678 2×10-3,r=0.999 6。结果表明,鬼臼毒素的进样量在0.047 69~0.476 9 mg/ml的范围内,浓度与峰面积呈良好线性关系。 2.6 精密度实验 精密吸取鬼臼毒素对照品溶液10 μl,按上述色谱条件,连续进样5次,依次测定各峰的峰面积值,结果鬼臼毒素对照品RSD=0.24%,表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性实验 精密吸取密封室温保存的八角莲根茎供试品溶液10 μl,分别于0,2,5,8,10 h进样,测定其峰面积值,计算RSD=0.84%(n=3),结果表明,供试品溶液在10 h内检测对结果无影响,稳定性良好。
2.8 重现性实验 取同一批八角莲根茎样品,按供试品溶液制备方法平行制备5份供试液,分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl,测定5份供试品中鬼臼毒素的含量,结果 RSD=1.50%。
2.9 样品测定 取3批八角莲根茎样品,按供试品溶液制备方法操作,分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl,注入高效液相色谱仪,用外标法测定,计算样品中鬼臼毒素的含量。结果见表1。
2.10 加样回收率实验 取已知含量的八角莲根茎样品5份,各约0.25 g,精密称定,分别加入鬼臼毒素对照品2.55 mg(2.55×93.5%=2.3843 mg),按供试品溶液制备方法操作,照上述色谱条件测定,计算回收率,结果平均回收率为99.94%,RSD=1.71%。
表1 八角莲中鬼臼毒素的含量测定结果(略)
表2 八角莲中鬼臼毒素加样回收率测定结果(略)
3 讨论
3.1 八角莲中鬼臼毒素的含量与提取方法有关 八角莲的有效成分为鬼臼毒素,有文献报道八角莲经80%甲醇超声提取,测得鬼臼毒素的含量为0.94%[2],采用文中所用的甲醇超声提取测得鬼臼毒素的含量为1.01%,结果表明,八角莲中鬼臼毒素的含量可能与提取溶剂、方法等有一定关系,值得进一步研究。
3.2 八角莲根中基本不含鬼臼毒素 通过比较八角莲根与根茎的HPLC图可以看出,八角莲根中基本不含鬼臼毒素,实验结果表明,主要是八角莲的根茎具有鬼臼毒素的抗癌抗病毒活性。
本法测定八角莲中鬼臼毒素的含量,样品预处理简单,有效成分分离良好,而且无其他成分干扰,对八角莲药材的质量控制有一定的参考价值。
【参考文献】
[1] 陈 黎,陈吉炎,安志斌,等.八角莲的性状与显微鉴别[J].中药材,2004,27(8):558.
[2] 俞培忠,姚莉韵,王丽平.HPLC法测定4种八角莲中鬼臼毒素的含量[J].上海医科大学学报,1998,25(6):452. |
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