高效液相色谱法测定地龙配方颗粒中次黄嘌呤的含量

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【摘要】  目的测定地龙配方颗粒中次黄嘌呤的含量。方法采用反相高效液相色谱法。色谱柱：Inertsil ODS-EP柱，流动相：水-甲醇-四氢呋喃（100∶0.5∶0.5），流速：1. 0 ml·min-1，检测波长：254 nm。结果次黄嘌呤在0.040 6～0.406 0 μg间与峰面积呈良好的线性关系，r＝0.999 9；平均加样回收率为97.6%，RSD为0.63%（n=9）。结论该法操作简便、准确，可用作为该制剂的含量测定方法。

【关键词】  地龙配方颗粒 次黄嘌呤 反相高效液相色谱

　　Abstract：ObjectiveTo determine the content of Hypoxanthine in Pheretima Compounding Granules.MethodsAn RP-HPLC was established.The chromatographic column was Inertsil ODS-EP.The mobile phase was H2O-CH3OH-C4H8O(100∶0.5∶0.5).The flow rate was 1.0 ml·min-1 ,and the detection wavelength was 254 nm. ResultsHgpoxanthine showed good linear relationship in the range of 0.040 6～0.406 0μg. The average recovery for Hypoxanthine was 97.6% and RSD was 0.63%(n=9).ConclusionThis method is simple, accurate and can be used for content determination of Pheretima Compounding Graunles.

　　Key words：Pheretima Compounding Granules;  Hypoxanthine;  RP-HPLC
   
　　地龙为巨蚓科动物参环毛蚓或正蚓科动物背暗唇蚓等的全虫体。性味咸寒，有清热、平肝、定喘、通络之功效，主治高热狂躁、惊风抽搐、风热头痛、目赤、中风半身不遂、喘息、喉痛、关节疼痛、齿衄、小便不通、瘰疬、痄腮、疮疡等疾病［1］。据报道次黄嘌呤是地龙扩张支气管成分，从地龙中分离出的次黄嘌呤有抗组胺、降血压等作用［2］。地龙配方颗粒的内在质量，本文以次黄嘌呤为指标成分，建立地龙配方颗粒中次黄嘌呤含量测定的高效液相色谱法，为本品质量控制指标提供参考。

　　1  器材

　　1.1  仪器日本岛津高效液相色谱仪（LC－10ATVP溶剂输送泵，SPD-10AVP紫外检测器）；HW－2000色谱工作站（南京千谱软件有限公司）。

　　1.2  试药与试剂次黄嘌呤对照品（国药集团化学试剂有限公司提供，批号F20040219，纯度为99.8%）；地龙配方颗粒剂样品（批号为030598，0407136，0409959，0504632，0507026）及缺地龙药材的阴性对照品（广东一方制药有限公司提供，规格为每袋1 g，相当于每袋10 g饮片）；甲醇、四氢呋喃为色谱专用试剂，其余为分析纯；水为双蒸水。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件及系统适用性实验色谱柱Inertsil ODS-EP柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，迪马公司）；流动相为水-甲醇-四氢呋喃（100∶0.5∶0.5）；流速为1. 0 ml·min-1；检测波长为254 nm。柱温：室温。分别取对照品溶液，供试品溶液和阴性样品溶液20 μl注入色谱仪，按上述色谱条件，记录色谱图（图1～3）。次黄嘌呤与样品中相邻色谱峰分离较好（R＞1.5），理论板数以次黄嘌呤峰计算应不低于2 600，保留时间约5.5 min。

　　图1  次黄嘌呤对照品HPLC图（略）

　　图2  地龙配方颗粒样品HPLC图（略）

　　图3  阴性对照样品HPLC图（略）

　　2.2  供试品溶液的制备取本品研细的粉末约0.075 g，精密称定，置于25 ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

　　2.3  阴性对照品溶液的制备方法同供试品溶液的制备相同。

　　2.4  对照品溶液的制备精密称取次黄嘌呤对照品20.30 mg，置于100 ml容量瓶中，加水超声处理溶解并稀释至刻度，摇匀，使成0.203 mg·ml-1贮备液，再精密吸取贮备液10 ml置于100 ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得次黄嘌呤浓度为0.020 3 mg·ml-1的对照品贮备液，分别精密吸取一定量的对照品0.020 3 mg·ml-1贮备液用水稀释成浓度为2.03，4.06，8.12，10.15，12.18，16.24，20.30 μg·ml-1对照品溶液，摇匀，即得。

　　2.5  线性关系考察分别精密吸取不同浓度的对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪测定，以峰面积（A）对对照品溶液浓度（C）进行回归，得回归方程A＝41 342C+6 140.3，r＝0.999 9。实验表明次黄嘌呤在0.040 6～0.406 0 μg范围内与峰面积有良好的线性关系。　　2.6  精密度实验取浓度为8.12 μg·ml-1的次黄嘌呤对照品溶液20 μl，注入液相色谱仪连续测定5次，记录峰面积并计算，结果次黄嘌呤峰面积的平均值为338 681，RSD为1.01%（n＝5），表明仪器精密度良好。

　　2.7  稳定性实验 取地龙配方颗粒供试品溶液（批号0409959），在0，2，3，4，6，8 h进样20 μl，记录峰面积，结果次黄嘌呤峰面积的平均值为194 873，RSD为1.46%，表明供试品溶液在8h内稳定。

　　2.8  重现性实验取同一批号（批号0409959）样品6份，按样品“2.10”项方法测定，结果次黄嘌呤平均含量为1.561 4 mg·g-1，RSD为1.96%，表明分析方法精密度良好。

　　2.9  加样回收率实验精密称取已知含量（批号0409959）的地龙配方颗粒样品约0.0750g，共9份，分别精密加入浓度为0.203 mg·ml-1的次黄嘌呤对照品贮备液，3.8，3.8，3.8，7.6，7.6，7.6，11.4，11.4，11.4 ml，按“2.2”项方法下制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样20 μl进行分析。结果见表1。

　　表1  加样回收率测定结果（略）

　　2.10  样品测定取不同批号地龙配方颗粒剂样品5批，按“2.2”项方法下制备供试品溶液，另精密吸取浓度为8.12 μg·ml-1的次黄嘌呤对照品溶液和制备的供试品溶液20 μl，注入液相色谱仪，测定，计算次黄嘌呤的含量。结果见表2。

　　表2  样品测定结果（略）

　　3  讨论

　　3.1  供试品溶液制备的选择分别考察了水和不同浓度的乙醇（10%～95%）溶液溶解样品，测定次黄嘌呤的含量，结果水溶解提取的含量最高，而乙醇随浓度增加次黄嘌呤的含量降低。说明次黄嘌呤在水溶液中的溶解度大于醇溶液。

　　3.2  对测定波长的选择取次黄嘌呤8.12 μg·ml-1对照品溶液和批号009959供试品溶液，用水做参比，置紫外可见分光光度计仪器中，在200～400 nm波长扫描，结果次黄嘌呤对照品和供试品溶液均在254 nm处都有最大吸收波长，故254 nm选择作为检测波长。

　　3.3  对流动相的选择我们参照有关文献使用水－甲醇－四氢呋喃（100∶0.12∶0.04）为流动相条件［3］，结果分离不太理想，我们尝试了不同比例水－甲醇－四氢呋喃流动相对分离的影响，结果说明水－甲醇－四氢呋喃（100∶0.5∶0.5）为流动相条件，地龙配方颗粒中次黄嘌呤可和其它组分基线分离，并且峰形良好。
   
　　实验结果表明地龙配方颗粒制剂不同批号的次黄嘌呤含量有较大差别，故在对其制剂作质量控制时，尤其重要。配方用次黄嘌呤含量作为制剂中相应的有效成分建立质量控制标准，能准确反映该制剂的质量。该方法分离效果好、简便、准确，可以作为衡量地龙配方颗粒制剂品质好坏的依据之一。

【参考文献】
  　　［1］ 龙艳华.地龙的化学及药理研究概况［J］.数理医药杂志，2005，18（4）：379.

　　［2］ 张理平，李如辉.地龙药理研究及临床应用的情况［J］.福建中医药，1990，21（6）：52.

　　［3］ 胡 馨，王 倩.HPLC法测定泸地龙中次黄嘌呤［J］.中草药，2005，36（6）：928.