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【摘要】 目的比较山茱萸不同炮制品中马钱素含量。方法高效液相色谱法。结果各炮制品中的马钱素含量相对于生品含量有所降低。结论不同的炮制方法对山茱萸中的马钱素含量有明显影响。
【关键词】 山茱萸； 炮制； 马钱素； 高效液相色谱法
The Comparison of the Contents of Loganin in Fructus Corni by Different Processes
Key words：Fructus Corni; Process; Loganin; HPLC
山茱萸具有补益肝肾、涩经固脱之功效，用于眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、遗尿、尿频、崩漏带下、大汗虚脱、内热消渴等症，是成药六味地黄丸、八味地黄丸等的重要原料。目前认为山茱萸中所含的熊果酸、齐墩果酸 、山茱萸苷、马钱素、没食子酸、莫诺苷等为其主要活性成分［1］，具有降低血糖、 增强免疫、利尿、降压、抗炎等药理作用［2］。《中国药典》2005版规定测定马钱素含量作为山茱萸药材质量控制指标［3］。山茱萸临床和入中成药多用其炮制品，并认为山茱萸生用以敛阴止汗力强，蒸制后以补肾涩精，固精缩尿力胜，酒炙后借酒力温通，助药势，降低其酸性，滋补作用强［4］。马钱素作为山茱萸中水溶性有效成分之一，其结构属于环烯醚萜苷类成分，炮制加热和加辅料对其含量肯定有一定影响，但目前尚未见到有关报道。本研究以马钱素为考察指标，比较不同炮制方法对其含量的影响，以期为制定山茱萸合理的炮制工艺提供实验依据。
1 器材
1.1 仪器与试剂BS210S型电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；高效液相色谱仪：LC-2010A(SHIMADZU)；检测器 SPD-M10A；工作站：Class－VP；H66025T超声清洗机（无锡超声电子设备厂）；101A-2型干燥箱（中华人民共和国上海市实验仪器总厂）；LDZX-40BI型立式自动电热压力蒸气灭菌器（上海申安医疗器械厂）。马钱素对照品（由北京格润得科技公司提供，纯度在98%以上）；黄酒（河南濮阳亚光酒厂）；甲醇（天津四友生物有限公司）、乙腈(杭州百林)为色谱纯；氯仿、无水乙醇等均为分析纯。
1.2 药材由宛西制药股份公司提供，产于河南西峡县山茱萸GAP种植基地，经河南中医学院生药学科陈随清教授鉴定为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Siet. et Zncc.的干燥成熟果肉。
2 方法
2.1 样品制备根椐《中国药典》净制要求，取山茱萸样品，除去杂质和残留的果梗和核，即为净山茱萸，再按不同炮制方法的要求炮制成为以下实验样品。
2.1.1 生品取山茱萸样品，除去杂质和残留的果梗和核，放置备用。
2.1.2 加压酒蒸品取净山茱萸100 g，缓慢加入40 ml黄酒搅拌均匀，加盖密闭闷润20 min后将样品放入压力锅中蒸制，待温度升至115℃后，保持该温度1 h，取出摊于瓷盘中，于烘箱中80℃烘3 h至干，取出，置干燥器中放凉备用。
2.1.3 酒蒸品取净山茱萸100 g，缓慢加入40 ml黄酒搅拌均匀，加盖闷润40 min，置于滤布上摊开，放在蒸笼上蒸3 h后，于烘箱中80℃烘3 h至干，取出，置干燥器中放凉备用。
2.1.4 酒炖品取净山茱萸100 g，缓慢加入20 ml黄酒搅拌均匀, 加盖闷润60 min，置不锈钢锅中，隔水炖3 h，摊于瓷盘中，于烘箱中80℃烘3 h至干，取出，置干燥器中放凉备用。
2.1.5 清蒸品取净山茱萸100 g，置于滤布上摊开，放在蒸笼上蒸3 h后，取出摊于瓷盘中，于烘箱中80℃烘 3h至干，取出，放于干燥器中放凉备用。
2.2 山茱萸不同炮制品中水分含量比较按照《中国药典》规定方法［3］分别称取山茱萸炮制品粗粉3 g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，精密称定，打开瓶盖，在105℃干燥5 h，将瓶盖盖好，移至干燥器中，冷却30 min，精密称定重量，再在上述温度干燥1 h，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5 mg为止。根据减失的重量，计算山茱萸不同炮制品中水分的含量。结果见表1。表1 山茱萸不同炮制品中水分的含量结果（略）
从山茱萸不同炮制品中水分含量可以看出，所有炮制品中含水量都在7%～13%以内，符合《中国药典》规定。此外，实验中所有炮制样品中的马钱素含量都按干燥品计算。
2.3 HPLC法测定马钱素含量
2.3.1 色谱条件色谱柱为ODS柱4.6 mm×250 mm(大连依利特)；乙腈-水（15∶85）为流动相；检测波长240 nm；柱温25℃；流速1ml/min；分析时间20 min。
2.3.2 对照品溶液的制备精密称取马钱素对照品0.46 mg置2 ml容量瓶中，加甲醇(色谱纯)使溶解并定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤（0.45 μm）,即得浓度为0.23 mg·ml-1马钱素对照品溶液。 2.3.3 标准曲线绘制依次自动进样马钱素对照品溶液1， 3， 5， 7 ，9 μl于高效液相色谱仪中，按上述色谱条件测定,并对结果进行分析。以峰面积积分值为纵坐标，对照品含量为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为：Y=1 274 329.13X-17 626.1，r=0.999 9。结果表明在0.23～1.15 μg范围线性关系良好。见表2和图1。表2 山茱萸马钱素标准曲线数据（略）
2.3.4 精密度实验连续自动进样马钱素对照品溶液5 μl，按前述条件测定峰面积积分值，计算RSD值，结果表明精密度良好RSD=0.097%。结果见表3。表3 精密度考察结果（略）
2.3.5 稳定性实验分别在0，2，4，6，8，10 h自动进样马钱素对照品溶液5μl，照前述色谱条件测定峰面积积分值计算RSD值，结果表明马钱素在10 h内稳定性良好,RSD=0.15％。结果见表4。表4 稳定性考察结果（略）
2.3.6 重复性实验称取山茱萸同一样品粗粉5份各约1 g，精密称定，按照供试品溶液制备方法和色谱条件，制备供试品溶液并注入高效液相仪，计算含量， RSD=1.63％。结果见表5。表5 重复性实验结果（略）
2.3.7 加样回收率实验取已知马钱素含量的山茱萸粉末约0.5 g，精密称定，共5份，分别加入马钱素对照品，以下按供试品溶液制备项下操作，得到5份加样回收供试液。自动进样各加样供试液10 μl，测定，用外标法根据峰面积积分值进行计算。结果见表6。表6 加样回收率实验结果（略）
每份加入对照品4.040 mg ，样品含量8.081 0 mg·g-1。
2.3.8 供试品溶液的制备各取样品粗粉约1 g，精密称定，置具塞三角瓶中，加入30%甲醇10 ml，超声提取15 min，倾出上清液抽滤，重复上述操作4次，用适量30﹪甲醇清洗残渣,合并滤液，定容至50ml容量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。
2.3.9 样品含量测定取各供试品溶液分别自动进样5μl，测定马钱素峰面积积分值，计算样品含量。对照品和样品色谱图见图2～4。结果见表7。表7 不同炮制品中的马钱素含量（略）
熊果酸含量和马钱素含量均是以干燥品计，且是两次测定的平均值
从表7可知，马钱素含量相对于生品含量均有所降低，由高到低依次为生品>酒炖品>加压酒蒸品>酒蒸品>清蒸品。
3 讨论
3.1 山茱萸由于药用历史悠久，炮制方法较多，本实验所采取的是临床常用的炮制方法，加压酒蒸、清蒸、酒炖、酒蒸等炮制工艺中的加酒量、闷润时间、炮制时间，均经正交实验优选确定。由于实验内容较多，篇幅所限，正交实验的研究过程没有报道。
3.2 实验结果表明，不同炮制方法和加入的辅料对马钱素含量有一定影响，其炮制品中马钱素含量相对于生品均有所降低，且以清蒸品含量最低。马钱素含量降低的原因可能是马钱素属于环烯醚萜苷类，在一定条件下易发生水解，炮制加热和加入辅料对其能产生一定影响的缘故。
3.3 据药理作用研究表明，山茱萸具有免疫调节、抗炎、抗休克、降糖、强心作用，其不同成分具有不同的免疫药理活性［4］。其中熊果酸体外具有一定的促进免疫效应，并有抑菌、安定、降温和抗糖尿病等作用［1］；马钱素在低浓度(0.016ｍｇ/ｍｌ)时有促进淋巴细胞转化作用而高浓度(0.500ｍｇ/ｍｌ)时则有抑制作用,提示马钱素对免疫反应有双向调节作用［5］。本研究以马钱素作为山茱萸不同样品的考察指标，正是以其药理作用为依据的，山茱萸炮制前后马钱素含量的变化，对其药理作用肯定有影响，其具体量效关系有待于进一步研究。
【参考文献】
［1］潘 扬,王天山.植物山茱萸化学成分的研究概况［J］.南京中医药大学学报,1998,14(1):61.
［2］郭富礼,张振凌. 山茱萸不同炮制品中熊果酸含量的比较［J］. 时珍国医国药,2002,13(7):404.
［3］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社,2000:22，附录53.
［4］龚千峰.中药炮制学［M］.北京：中国中医药出版社，2003：302.
［5］楚 晋.山萸肉化学成分及其药理活性的研究［J］.中国自然医学杂志,1999. 11(1):46. |
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发表于 2014-8-16 23:43:52
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