马齿苋提取物对肝癌细胞HepG-2抑制作用的实验研究

amy54321 · 发表于 2014-8-16 23:39:55

作者：崔香淑，金元哲，张学武

【摘要】  目的观察马齿苋提取物对肝癌HepG-2的抑制作用。方法采用MTT比色法观察马齿苋提取物抑制肝癌HepG-2细胞增殖；采用流式细胞仪检测马齿苋对HepG-2细胞周期分布的影响。结果马齿苋提取物可抑制肝癌HepG-2细胞增殖，其作用具有时间和浓度依赖性；可改变细胞周期分布，多数细胞阻滞于S期，与对照组比较，细胞凋亡率差异有显著性(P<0.01)。结论马齿苋提取物可诱导肝癌HepG-2细胞凋亡，改变细胞周期分布，从而抑制细胞增殖。

【关键词】  马齿苋；细胞周期；细胞凋亡

　　Inhibitory Effects of Portulaca oleracea L. on Hepatocellular Carcinoma HepG-2 Cells

　　Abstract：Objective To investigate the inhibition of Portulaca oleracea L. on proliferation hepatoma HepG-2 cells.MethodsMTT assay was used to examine the effect of Portulaca oleracea L. on the proliferation of HepG-2 cell and flow cytometry was used for the cell cycle distribution.ResultsPortulaca oleracea L. inhibited the proliferation of HepG-2 cell and the effects were in a time-concentration dependent manner. Portulaca oleracea L.  also induced apoptosis, the Sphase was arrested. There was significantly difference in the ratio of apoptosis from control group. ConclusionPortulaca oleracea L. inhibits proliferation of HepG-2 cells via induction of apoptosis and cell cycle arrest.

　　Key words：Portulaca oleracea L. ;  Cell cycle;  Apoptosis

长白山马齿苋为马齿苋科植物马齿苋（Portulaca oleracea L.）的干燥地上部分，药食同源，夏秋两季采收。马齿苋收录于《中国药典》［1］，具有清热解毒，凉血止血功效，用于热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便血、痔血和崩漏下血等。近年来被确定为长白山抗癌药，有学者用其与其它中药配伍来治疗大肠癌、葡萄胎、绒癌等取得了一定的疗效［2］。本实验选用肝癌HepG-2细胞株作为研究对象，研究马齿苋提取物对肝癌HepG-2细胞增殖的作用，以及马齿苋对细胞周期分布和凋亡的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  细胞株HepG-2细胞购于南京凯基生物技术公司。

　　1.1.2  药物及试剂马齿苋正丁醇提取物：将药材适度粉碎，马齿苋购于吉林省延吉市联邦大药房，经延边大学药学院生药教研室鉴定为真品。取马齿苋400 g，80%乙醇提取，蒸出溶剂，水层用正丁醇萃取，蒸干后得浸膏20 g(1 g马齿苋浸膏相当于40 g生药)。噻唑兰购自美国Sigma公司；RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司；小牛血清购自北京华美生物工程公司；胰蛋白酶购自美国DIFCO公司。

　　1.1.3  仪器OLYMPUS倒置显微镜购自日本；RT-2100型酶标仪购自美国；FACS Calibur流式细胞仪购自美国；JEM-1200EX透射电子显微镜购自日本；PD-2000真彩色病理细胞图像分析仪购自北京天地百年科技公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  HepG-2细胞培养肝癌HepG-2细胞贴壁生长，培养于含10%灭活小牛血清，含100 U/ml 青霉素及100 U/ml链霉素的RPMI1640培养液中，置37℃，相对湿度为90%、5%的CO2孵箱内培养。

　　1.2.2  MTT比色实验取对数生长期的HepG-2细胞按每孔1×105 个细胞接种于96孔板中，每孔体积200 μl。24 h后换液，马齿苋组加入马齿苋提取物使其终浓度分别为50，100和200 μg/ml，另设终浓度为25 μg/ml 的5-Fu阳性对照组和不加药物的阴性对照组以及不接种细胞的空白对照组。分别培养24，48 h，每个浓度每个时点均设4个复孔。于终止前4 h，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，继续孵育4 h后弃去上清液，加入150 μl DMSO，轻轻振荡10 min，使结晶物完全溶解，于490 nm波长处在荧光酶联分析仪上测光吸收值(A值)，计算抑制率(IR)。
IR(%)=(对照孔A值一实验孔A值)/对照孔A值×100%

　　1.2.3  流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期分布对照组和100 μg/ml马齿苋组细胞培养48 h后，收集各组细胞悬液1 ml，浓度约为106个/ml，离心（1 000 r/min, 5 min），弃掉培养液，70%冷乙醇固定，4℃ PI暗染30 min，流式细胞仪检测，采用 ModfitLT3.0 软件对各组样本进行DNA含量及细胞周期分析。

　　1.3  统计方法应用SPSS11.5统计软件进行相关性分析和方差分析，数据采用±s表示。

　　2  结果

　　2.1  对HepG-2细胞生长的影响

　　2.1.1  细胞生长形态变化对照组HepG-2细胞呈上皮型贴壁生长，细胞呈延展、扁平，细胞均质而透明，细胞一般有2～4个核仁，核膜、核仁轮廓明显，细胞间结构紧密，细胞生长旺盛。马齿苋组、阳性对照组细胞轮廓增强、反差增大，变圆浮起，细胞间接触变松，增殖减慢，胞质中颗粒增多；HE染色染色质浓缩，呈深染的新月体形，可见凋亡小体。　2.1.2  MTT比色实验不同浓度处理组分别培养24，48 h，马齿苋提取物对HepG-2细胞生长有抑制作用，且其抑制作用具有时间和浓度依赖性。随着时间的延长和药物浓度的增加，细胞抑制效果越明显，药物对肿瘤细胞生长有量效、时效关系。当马齿苋浓度为100 μg/ml作用时间为48 h时，对HepG-2细胞的抑制率为47.58%，接近半数抑制浓度(IC50)。结果见表1。表1  马齿苋提取物体外对HepG-2细胞的抑制作用（略）

　　2.2  对细胞周期分布的影响

　　100 μg/ml马齿苋提取物处理HepG-2细胞48 h后，在 G0/G1 期、G2/M和S期的细胞分别为56.49%、11.02%和 32.49%；而未经药物作用的对照组细胞的G0/G1期为54.79%，G2/M期为22.11%，S期为23.10%。可见马齿苋提取物作用下， S期细胞比率显著上升，多数细胞阻滞在S期。结果见表2。

　　2.3  流式细胞仪检测细胞凋亡100 μg/ml马齿苋提取物作用于HepG-2细胞48 h后，流式细胞仪检测DNA 含量，可见明显的细胞凋亡峰，其凋亡率为 27.01%，与对照组细胞的凋亡率5.47%比较有显著性差异（P＜0.01）。结果见表 2。表2  马齿苋提取物对细胞周期和凋亡率的影响（略）

　　3  讨论

细胞凋亡普遍存在于大多数肿瘤组织细胞中，与肿瘤的发生、发展及退化有密切的关系［3］。现已明确，大多数抗肿瘤药物都能诱导敏感肿瘤细胞发生凋亡，并且其抗肿瘤效能与肿瘤细胞在药物诱导下发生细胞凋亡的内在活性有关［4］。因此，通过观察是否能诱导肿瘤细胞凋亡已成为寻找抗肿瘤药物的新靶点，以及评价疗效的一项新指标［5］。本实验中MTT结果显示马齿苋提取物对HepG2细胞的增殖具有明显的抑制作用。其细胞生长抑制随着药物浓度的升高和时间的延长而增加，具有量效、时效关系。倒置显微镜、HE染色、透射电镜及流式细胞术结果，说明马齿苋提取物可以诱导肝癌HepG2细胞凋亡。同时，马齿苋提取物能明显抑制HepG2细胞的周期变化，使其阻滞细胞停止于S期，使细胞周期改变而诱导细胞凋亡。

【参考文献】
  　　［1］中华人民共和国卫生部药典委员会. 中国药典，Ⅰ部［S］.广州：广东科技出版社，1995：37.

　　［2］刘春安，彭明.抗癌中药大辞典［M］.武汉：湖北科学技术出版社，1994：127.

　　［3］段小梅. 基因家族对细胞凋亡的调控［J］.中国医学文摘肿瘤学，2001，15（1）：80.

　　［4］黄韧敏，袁淑兰.丹参酮ⅡA诱导HL-60细胞凋亡［J］. 癌症，1998，17(3)：164.

　　［5］李英．鸦胆子油乳诱导白血病U937细胞凋亡的实验研究［J］. 中华血液学杂志，2004，25(6):381.

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