基因芯片技术在中药基因组学研究中的应用

amy54321

      作者：唐先明，王振月，赵海鹏，王宗权， 陈智岩

【摘要】  该文基于现代基因组学特别是功能基因组学及一些生物技术手段的研究进展及发展趋势,从一个新的视角提出了开展“中药基因组学(TCM Genommics)”研究的策略。认为当前中药的现代化研究应集中体现于中药基因组学,并将以基因芯片等为核心的基因技术引入中药基因组学和现代中药研究。将中药的作用机理或功能利用能代表其功能的一组基因表达的影响来诠释。

【关键词】  基因芯片; 中药基因组学; 中药现代化

　　Abstract：In this paper a new research strategy of “TCM Genomics”is proposed on the basis of achievements and advances in the fields of HGP, biochip proteomics,biotechnology and modern analytic technologies. In order to elucidate the action or function of TCM with its regulation to a group of genes that represent this action or function. We presume that modernization of TCM should focus on TCM Genommics and apply gene technology centred upon gene chip to TCM Genommics and modern research of TCM.

　　Key words：Gene chip；  TCM Genommics；  Modernization of TCM

    化学曾经在中药研究与开发领域扮演了极为重要的角色，但今天药物研究与开发的基础已经由化学转变为生物学，尤其是分子生物学、基因组学和生物信息学。基因芯片作为20世纪90年代新兴的高度集成化的分析和研究手段，正在成为进行药物基因组学研究的主要平台。本文就基因芯片技术在中药基因组学研究中的应用进行综述。

　　1  基因芯片和中药基因组学的含义

    基因芯片（gene chip）又称DNA芯片，是专门用于核酸检测的生物芯片，也是目前运用最广泛的微阵列芯片。它是指在固相载体上按照特定的排列方式固定大量序列已知的DNA片段，形成DNA微矩阵。将样品基因组DNA/RNA通过体外转录、PCR/RT-PCR扩增等技术掺入标记分子后，与位于微阵列上的已知序列杂交，通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描，检测杂交信号强度，计算机软件进行数据的比较和综合分析后，即可获得样品中大量的基因序列特征或基因表达特征信息 ［1，2］。
    药物基因组学是分子药理学与分子生物学有机结合,研究药物效应基因的变异与药物效应之间的关系,其中所包含的中药基因组学(TCM Genomics)则是通过现代科技手段结合传统中药理论和现代科学理论，将中药的药性、功能及主治与其对特定疾病相关基因表达和调控的影响关联起来，在分子水平上用现代基因组学，特别是用功能或疾病基因组学的理论来诠释传统中药理论及作用机理［3］。

　　2  基因芯片在中药基因组学研究中的应用

    基因芯片是研究分析基因的一种强有力的分子生物学技术，是进行表达中药基因组学研究的主要工具［4］。通过中药基因组学研究，可开发中药基因芯片。中药基因芯片作为“中药基因组学”的又一重点,将从根本上改变长期以来人们对中药的研究手段和认识层次。中药基因芯片将是高通量、高效率的从分子水平上研究中药的最新技术手段。中药基因芯片包括分类、鉴定芯片和药物筛选芯片两种重要类型,前者可以用于对中药材料及制成品的定性、定量分析,在药物鉴定、质量保证方面具有极为重要的应用价值,还可用于寻找、发现中药新基因；后者用于中药的药效筛选以及药理分析,还可用于证实、发现中药新品种。

    而在药物的遗传学研究中，基因芯片是进行候选基因的多态性筛查的有效手段。目前研究表明大部分人基因高频等位基因变异，而约有90％的变异是单核苷酸多态性(SNP)［5］，在人类基因组上大约有142×108 SNP。而这些SNP构成了大部分人类多样化表型的遗传基础。将影响药物反应的所有多态性基因置于一张芯片上作为临床分子诊断工具，用来选择适于个体的合适药物治疗方案和剂量，是实现个体化给药的前提［6～8］。

　　2.1  药靶的研究药靶确切的含义是指药物直接作用的生物大分子物质，选择合适的药靶是基于机理筛选药物的关键因素之一。目前已知可作为药靶的基因约500个，Drews和Roses等［9，10］认为，在人类基因组中可用于疾病治疗的药物靶点有3 000～10 000个。由此可见，在药靶的发现与研究领域还有相当的空间，而我国具有数千年临床研究与应用历史的中药，在这一领域具有得天独厚的发展优势。中药对一些疑难杂症具有良好疗效，但在药靶及其作用机制的研究方面则非常薄弱，基因芯片技术的应用将有助于改变这一局面。利用基因芯片技术通过比较正常组织（细胞）及病变组织（细胞）在有效药物或者没有药物作用下的基因表达水平的变化，从而发现一组疾病相关基因或者药物反应基因作为中药筛选靶标。利用此技术可以找到多重药物反应基因，这些药物反应基因提供了多重干涉节点，这些反应基因可能会成为新的药靶，用于筛选新的中药品种，扩大中药药源,也可以成为协同治疗方案开发的基础。使中药的性味归经理论以及复方配伍理论和中药的作用靶点在基因组的水平上结合起来，真正在分子水平上诊病、治病。不仅为一些新基因的功能研究提供了线索，而且为研究中药作用的分子机制提供了一个新的技术平台。Mandel等［11］利用基因芯片建立帕金森病的基因表达指纹（fingerprints）图谱，发现了多种有利于抗帕金森病药物研制和开发的潜在药靶。

　　2.2  中药作用机制研究由于单味药成分的复杂性以及传统复方和民族药的多样性等特点,中药疗效的发挥可能涉及到多个药效靶点,在以往的研究中往往采用免疫组织化学法、流式细胞仪检测法等,需要将每个样品分别进行测试,操作繁琐,而且不能从生物整体系统的角度探讨药物的作用机制,使得中药作用机制的研究遇到很大困难。大量研究发现,许多疾病与基因结构、基因调控和表达异常有关,而用中药治疗这些疾病能取得显著疗效且毒副作用小。因此,从基因水平上研究中药治病的机制就显得非常有意义。基因芯片技术的出现及发展给中药作用机制的研究提供了有力的工具。

    药物与细胞相互作用，将引起细胞外部形态及内部正常代谢过程的一系列变化。其内部生理活动的变化可集中表现在其基因表达的变化上。基因芯片能够确定靶组织的基因表达模式，可将中药作用的所有靶基因全部显示出来,从而提供了在全基因组的基础上了解药物作用机制的线索。由基因芯片所获得的大量信息也可以用来阐述直接药效下游的药物反应个体差异，从而从基因组的高度，在分子水平上解释中药药证、方证的基因组原理，发现、研究中药在人类基因组上的整体作用原理，即基因组药理；研究方剂对基因组的整体作用原理，在分子水平上进一步把方剂精确化、简单化或者分子化，把中药的作用机理推向分子水平。Yin等［12］在用cDNA微阵列研究半枝莲（Scutellaria barbata D.Don）的抗癌机制中发现16个基因(包括DNA损伤、细胞周期调控、蛋白质磷酸化的相关基因)上调了5倍以上,提示这些过程可能参与了半枝莲诱导的癌细胞死亡。Bonhamp等［13］采用cDNA芯片分析一种中药成分PC-SPES治疗前列腺癌的作用机制，发现该成分作用于LNCaP前列腺癌细胞株24 h后，有156个基因表达发生了改变。有趣的是，编码细胞周期调控蛋白、α和β微管蛋白及雄激素受体的基因表达都下调，提示PC-SPES介导的细胞毒作用可能是调控细胞周期、细胞结构及雄激素反应的基因改变的结果。

　　2.3  中药毒副作用研究由于中药的作用机理是复杂的，在传统意义上讲是通过调节机体的整体功能而起治疗作用。利用传统药理毒理研究方法，对中药从整体、器官、细胞乃至分子水平很难进行较全面的评价。在中药提取物作用于动物的前后阶段，利用基因芯片技术将动物特定的细胞中相关功能基因表达差异变化进行对比，将中药的毒副作用与基因表达特征联系起来，通过基因表达分析便可确定药物的毒性，使得中药的毒副作用或不期望出现的效应在临床前实验得以确认。利用基因芯片可以在一个实验中同时对成千上万个基因的表达情况进行分析，为研究中药对生物系统的作用提供全新的线索。该技术可对单个或多个有害物质进行分析，确定药物在低剂量条件下的毒性，分析、推测毒性物质对不同生物的毒性可比性［14,15］。如果不同类型的有毒物质所对应的基因表达谱有特征的规律，那么，通过比较对照样本和有毒物质的基因表达谱，便可对各种不同的有毒物质进行分类，在此基础上通过进一步建立合适的生物模型系统，便可通过基因表达谱变化来反应中药对人体的毒性［4］。 Kiela等［16］在研究印度乳香(Boswellia serrata Roxd)的提取物时发现该药高剂量不仅不改善肠炎的症状,而且利用基因芯片分析肝脏基因的表达谱时发现,高剂量组中与脂质代谢相关的大量基因表达的失调,表明高剂量给药时,该药具有肝毒性。

　　2.4  中药有效成分筛选由于技术手段的限制，传统的分析方法在中药有效成分筛选方面大多集中在采用化学或物理方法对中药的有机化学成分 （如黄酮类、甾醇类、苷类等）进行分析及合成，然后利用细胞及动物评价药效, 关心的只是某一种中药或某一种药理作用,而完全忽视了中药特别是复方制剂的多重作用及中药的整体治疗观。特别是采用有机溶剂提取化学成分的分析方法，与中药的水煎口服以摄取水溶性成分为主的用药途径之间可能存在差异和矛盾。另一方面，由于很多中药有效成分是以微量化学成分形式存在的，而传统的有效成分分析、提取技术难以胜任这一工作。因此往往历经千辛万苦最终所获甚少,即使偶有成功,也难成就中药理论,进而怀疑甚至不相信中药理论的科学性。如何解决这类问题，是中药现代化领域备受关注的焦点之一。而基因芯片技术是解决这一问题的主要手段。

    中药有效成分的筛选采用基因芯片进行基因表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况。这给中药有效成分的筛选提供了一种便利的方法。一种中药有治疗效果主要是通过调节机体部分或整体机能而实现。从基因组的观点看，就是通过对基因的表达调控而起作用。据此，通过基因芯片技术，分析某种中药成分使用前后整个机体的不同组织、器官基因表达差异，就可以从众多的中药成分中迅速筛选到起作用的有效成分。同时可以了解这种成分的作用靶点。这不仅仅是为了弥补传统方法的缺陷，更重要的是在中药新药研究领域，建立全新的理念和先进的研究手段，使中药现代化真正进入一个宽广的良性发展的轨道。

    据报道，香港科技大学生物技术研究所利用基因芯片技术已筛选到知母的23种有效成分，如果再从cDNA表达文库中得到的肽库制作肽芯片，则可以从众多的药物成分中筛选到起作用的部分物质。　　2.5  与药物代谢转化相关基因的研究探讨中药与其治疗疾病基因间的作用关系,为丰富基因组学研究和推动中药作用机理研究将起到积极的作用。在中药中含有数百种甚至更多的具有生物活性的物质,它们对于维持人类的健康起了很大的作用,特别是一些植物的代谢产物,能影响细胞的信号传递、基因表达,最终影响整个生物体。有研究表明这些生物活性物质深度地影响了有机体的生长与发育,有机体的基因型也强烈地影响了对所摄取的分子的生理反应。不同的发病原因可能造成相同的类型，而且不同的基因型会导致不同的疾病易感性和对药物不同的耐受能力［17］。用药也需因人而异。凡此种种，都是由不同个体的遗传学差异引起的，从药物反应的角度来说，是机体内的药物应答相关基因决定了个体对药物反应的差异。人群中存在的遗传多态性对个体疾病易感性和药物反应有影响。人类基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性，疾病临床表现的多样性，以及对药物治疗的反应性上都起着重要作用［18］。而基因芯片提供了全基因组范围的扫描多态性的工具，可以同时检测一个个体成千上万个多态性位点。检测出各种单一成分或复方成分的药物应答相关基因、以及各种成分对药物应答相关基因的作用特点［19］。对少数个体用传统的DNA测序等方法发现SNP，根据这些SNP信息设计芯片，就可以对大量个体进行再测序。基因芯片的SNP分析能够帮助研究者将疾病患者分成“反应者”和“非反应者”，应用到中药基因组学中，将能够预测那些个体可能会产生严重副反应，从而为每个患者选择最合适的药物治疗方案。此外，还可以利用基因芯片技术通过基因组扫描技术鉴定和疾病相关的点突变，开发和重新定义诊断方法，建立个体化药物检测指标，帮助预测治疗反应［20～22］。

    目前单核苷酸多态性只是用于作为基因组上的位置标记，希望利用它们在染色体上距离的远近找到与特定标记功能相关的多态性。这样基因组范围的相关研究，已经用于发现疾病易感基因，如哮喘和胰腺癌。但是这项技术也适用于定义那些涉及药物反应的基因。基于基因型对患者进行细分类，可以抢救一些在标准临床实验中因为无法接受的毒性发生率而被淘汰的有用的实验药物，这类药物可能对某类细分人群毒副作用率低［23］。减少药物的不必要淘汰，提高新药批准率。

　　2.6 中药质量控制能够准确地鉴定中药是保证中医临床用药安全有效、可持续发展的前提。常规的中药鉴定是采用性状、显微、物理、化学等方法。这种依据形态和解剖学特征及化学成分为基础来进行中药材鉴定的方法有着方法简便、易行等优点。 但是，当缺乏完整的形态结构，特别是对中药复方制剂中药用组分的鉴别，用常规的方法“鉴定”就显得异常复杂甚至无能为力。基因芯片技术为我们提供了一种全新的方法。我们可以从正品中药的基因组中分离出DNA与基因芯片杂交就得出标准图谱。从欲鉴定的中药的基因组中分离出DNA与基因芯片杂交就得出工图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出欲鉴定中药的DNA信息。从而可以便捷、准确进行单味中药及中药复方制剂的鉴别。这种基因芯片鉴定技术以其快速、高敏、经济、平行化、自动化等特点，将成为中药物种的分类鉴定、识别假冒伪劣药材现代化的新技术。此外，用于检测基因表达水平的DNA芯片已研究完成，应用该技术通过定量分析可进行复方制剂质量的标准化研究等。

    杨忠等［24］首先提取来自多种贝母根茎的基因组DNA,对26SDNA基因D2与D3区的多态性片段进行直接测序,将针对不同种属多态性片段的特异性寡核苷探针点制于经多聚赖氨酸处理包被的芯片。然后设计特定引物,用来自不同种属贝母的PCR产物与固定的寡核苷探针进行杂交,由于在PCR反应过程中使用了荧光素标记的ddNTPs,不同贝母种属即可在芯片不同位置检测到荧光信号，从而提供了一种快速高效的集基因分型和中药鉴别于一体的方法，显示基因芯片技术可为植物种属的验证与质量控制提供一种快速、高质量的检测工具。

    除上述基因芯片在中药基因组学研究中的应用外,利用基因新片技术还有助于从整个基因组的水平来阐明重要的、常用的或珍稀濒危品种的植物性中药基因在染色体的位置、结构、基因及其产物的功能、基因与基因之间的相互关系,搞清功能基因和次生代谢的酶基因,进而进行“工厂化生产”或“田间种植”［25］。

　　3  结论

    我们的传统中医药学在历史上对中华民族的健康发挥了重大贡献，但是和现代药物相比较，还具有很多缺点。我们应结合科学的整体论基础和现代的科学技术，将中医药学的优秀思想和最先进的科学技术相结合，建立完善的中医药特色的基因组学，吸收现代医药学的优点，扬长避短，才能完全发挥中医药的特色，科学解释、发展和完善中药学，使其成为一门崭新的生命科学，为人类的健康作出新的贡献。

    将基因芯片技术应用到中药基因组学，一方面可以加速中药基因组学的发展，主要是利用基因芯片技术进行基因功能及多态性的研究，以确认与药物效应相关的基因，并查明这些基因的多态性；另一方面利用中药基因组学的研究成果，结合基因芯片技术，可以将人类按基因型分群，以实现中药基因组学研究的目的和价值。因此基因芯片在中药基因组学研究中有着重要地位。

【参考文献】
  　　［1］陈忠斌. 生物芯片技术［M］. 北京：化学工业出版社，2005：2.

　　［2］Schena M.DAN Microarrays［M］. Oxford University press,Oxord,1999：87.

　　［3］王升启.试论“中药基因组学”与“中药化学组学”［J］.世界科学技术-中药现代化，2000,2(1):28.

　　［4］Shinji.Koizumi.Application of DNA Microarrays in Occupational Health Research［J］.JOccup Health,2004,46:20.

　　［5］Cargill M, Altshuler D, Ireland Jet al.Characterizationof single-nucleotide polymorphisms in coding regions ofhuman genes.Nat. Genet.1999,22: 231.

　　［6］Rees JL Genetics of hair and skin color［J］.Annu Rev Genet,2003, 37: 67.

　　［7］李 瑶,裘敏燕,裴 军,等.基因芯片与功能基因组［M］.北京：化学工业出版社，2004：254.

　　［8］刘殿武,杜玉涛.人类基因组单核苷酸多态性研究进展［J］.疾病控制杂志，2006,10(4):403.

　　［9］Drews J. Genomic sciences and the medicine of tomorrow［J］.DDT.2000,5(1):2.

　　［10］Roses AD.Genome-based pharmacoge-netics and the pharmaceutical industry.Nat Rev Drug Discov,2002,1(7):541.

　　［11］Mandel S,Weinreb O,Youdim MB.Using cDNA microarray to assess Parkinson's disease models and the effects of neuroprotective drugs［J］.Trends Pharmacol Sci,2003,24(4):184.
　　［12］Yin X,Zhou J,JieC,et al.Anticancer activity and mechanism of Scutellaria barbata extract on human lung cancer cell lineA549［J］.Life Sci,2004,75(18):2233.

　　［13］Bonlmm M，Arnold H，Montgomery B，et a1.Molecular effects of the herbal compound C-SPES：identification of tivitypathwaysinprostate carcinoma ［J］.Cancer Res,2002，62(14)：3920.

　　［14］Lee GJ,Lee WS,Jeon KS,et al.cDNA Microarray Exprssion Analysis and Toxicological Phenotype for Anticancer Drug［J］.J.Vet.Med.Sci.2004,66(11):1339.

　　［15］Steven J,Bulera SM,Eddy E,et al.RNA expression in the early characterization of hepatotoxicants in Wister rats by high-density DNA microarrays［J］.Hepatology,2001,33:1239.

　　［16］Kiela PR,Midura AJ,Kuscuoglu N,et al.Effects of Boswellia serrata in mouse models of chemically induced colitis［J］.Am J Physio Gastrointest Liver Physiol,2005,288(4):798.

　　［17］Htratsuka M,Ebisawa A,Matsubara Y, et al.Genotyping of Single Nucleotide Polymorphisms(SNPs) Influencing Drug Response by Competitive Allele-spcific Short Oligonucleotide Hybridization (CASSOH) with Immunochromatographic Strip［J］.Drug Metab Pharmacokin, 2004,19(4):303.

　　［18］Hirohisa Saito. Translation of the human genome into clinical allergy［J］.Allergology International,2003,52: 65.

　　［19］Debouck C, Goodfellow PN .DNA microarrays in drug discovery and development［J］.nature genetics supplement,1999,21:48.

　　［20］Pollard HB,Eidelman O,Jacobson KA.Pharmacogenomics of cystic fibrosi［J］.Mol Interv,2001,1(1):54.

　　［21］Lymberis SC,Parhar PK, Katsoulakis E.Pharmacogenomics and breast cancer ［J］.Pharmacogenomics, 2004, 5(1):31.

　　［22］Anno S, Kudo S, Hamasaki K,et al. Techniques of SNP Genotyping and Remote Sensing Applied for Elucidation of the Contribution of Polygene and Environmental Factors to Inter-individual Variation in Skin Pigmentation Phenotype［J］.J Physiol Anthropol Appl Human Sci, 2005,24: 483.

　　［23］Weinstein JN.Pharmacogenomics-teaching old drugs new tricks［J］.New Engl J Med.2000,343:1408.

　　［24］杨 忠,张亚欧,黄文秀,等.基因组学与生物芯片技术在中药研究与开发中的应用［J］.药学学报,2002.37（6）:490.

　　［25］肖乐义,薛歧庚,董建军,等.开展“中药基因组计划”的研究［J］.中草药.2001,32:1.