黄芪多糖对遗传性糖尿病kkay小鼠视网膜中TNF-α表达的影响

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    作者：吴璧，王保华，欧阳静萍

【摘要】  目的探讨黄芪多糖（APS）改善糖尿病KKAy小鼠视网膜病变的作用及机理。方法将KKAy（n=16）和C57BL/6J（n=20）小鼠随机分为：对照（C）组，糖尿病（KK）组，糖尿病APS治疗（K+A）组。检测小鼠一般情况、血糖水平、血胰岛素水平及视网膜组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达。结果治疗8周后，K+A组血糖降低，胰岛素敏感性增强，视网膜组织中TNF-α表达降低（P<0.05 vs KK）。结论APS能改善糖尿病KKAy小鼠视网膜病变，其机制与减轻TNF-α表达，改善胰岛素抵抗有关。

【关键词】  糖尿病视网膜病变； 黄芪多糖； KKAy小鼠； 胰岛素抵抗


    糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病眼部并发症中最严重的病变，是糖尿病最为常见和严重的微血管并发症之一。而增生性糖尿病性视网膜病变则为DR的最严重阶段，能导致双眼不可逆性盲，已成为主要致盲眼病之一。虽然近年来的糖尿病视网膜病变治疗进展使这种病变致盲的危险性大大降低，但是糖尿病仍然是最常见的疾病之一，所以视网膜病变依然是一个很严峻的问题［1］。

    KKAy小鼠是遗传性糖耐量异常KK小鼠转入黄色肥胖基因（Ay）后得到，高脂饮食后出现肥胖，具有2型糖尿病的特征，被学术界视为理想动物模型；而C57BL/6J小鼠与KK小鼠基因型相同，普通饮食下无糖尿病发生，常作为其对照组。黄芪多糖（astragalus polysaccharides, APS）是黄芪的主要药理成分，本研究组前期研究证实其具有降糖和胰岛素增敏作用［2］。本研究以KKAy糖尿病小鼠为研究对象，旨在探讨黄芪多糖对糖尿病视网膜病变的作用及机理。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物SPF级小鼠购自中国医学科学院，置于武汉大学ABSL-Ⅲ动物中心。KKAy鼠饲以高脂饲料（58%脂肪，25.6%碳水化合物，16.4%蛋白质），C57BL/6J鼠饲普通饲料（12%脂肪，60%碳水化合物，28%蛋白质）。

　　1.2  材料

　　APS［3］提取自膜荚黄芪（上海药材公司），生理盐水配制；甘油三脂测定试剂盒（中北生控科技股份有限公司）；游离脂肪酸测定试剂盒（南京建成生物科学研究所）；胰岛素（美国Sigma 公司）；BCA蛋白定量试剂盒（美国Pierce 公司）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）单抗（美国Santa Cruz 公司）；SP试剂盒（北京中山生物技术公司）；DAB试剂盒（福州迈新公司）；One Touch血糖仪、试纸（美国强生公司）。

　　1.3  方法

　　1.3.1  分组随机血糖>13.9 mmol/L的KKAy和正常C57BL/6J小鼠随机分为：糖尿病（KK，n=8）组；糖尿病APS治疗（K+A，n=8）组；对照（C, n=10）组。APS溶液灌胃〔700 mg/(kg·d)，8周〕，对照组予等量生理盐水灌胃。

　　1.3.2  指标检测测体重、血糖、空腹胰岛素（禁食12 h）、血脂。处死前10min每组半数动物腹腔注射胰岛素（10 U/kg）。光镜观察视网膜病理改变。免疫组织化学方法测TNF-α蛋白表达量，并采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统随机检测其在各组100个内皮细胞中的平均光密度值进行半定量分析。

　　1.3.3  胰岛素抵抗（IR）判定行OGTT［4］试验并计算HOMA IR［5］综合分析。

　　1.3.4  统计学处理计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间均数比较采用方差分析及q检验，数据由spss11.5统计软件处理。

　　2  结果

　　2.1  一般情况KK组小鼠毛色浑暗，倦卧；K+A组小鼠毛发光亮，精神佳。K+A组小鼠体重、血糖、空腹胰岛素及血脂含量均显著低于KK组（P<0.01），但胰岛素水平改变不显著（P>0.05）。C组小鼠一般情况正常，各项指标均无显著性差异（P＞0.05）。结果见表1。　　2.2  胰岛素抵抗情况APS治疗前KK组口服葡萄糖后血糖上升快，且维持在高值，HOMAIR显著高于C57BL/6J小鼠（P< 0.01）。K+A组小鼠各时点血糖值及HOMA IR均显著低于KK组（P<0.05）。两对照组间差异不显著。结果见表1。表1  各组血糖、血脂、血甘油三酯、胰岛素抵抗及体重的比较（略）

　　2.3  视网膜病理改变C组小鼠视网膜各层结构清楚，外核层和内核层细胞排列比较整齐。与C组相比，KK组及K+A组视网膜明显变薄，且内外核层细胞排列紊乱。KK组视网膜神经节细胞数较C组明显减少，但K+A组神经节细胞数较KK组有明显增加。K+A组整个视网膜厚度较KK组增厚。

　　2.4  视网膜TNF-α表达情况K+A组TNF-α表达显著低于KK组（P<0.01），与对照C组间无显著性差异（P>0.05）。结果见图1。

　　3  讨论

    本实验结果显示，高脂喂养12周KKAy小鼠可出现典型胰岛素抵抗（高血糖、高胰岛素、糖耐量下降，HOMAIR高）和视网膜的病变。APS治疗可减轻体重，血糖（脂）含量降低，胰岛素抵抗和视网膜病变得以改善，同时APS治疗可降低视网膜组织中TNF-α蛋白表达。

    糖尿病视网膜病变的发生发展是多因素、多阶段作用的结果，不仅与血糖升高有关，而且脂类代谢紊乱以及许多细胞因子也在其病理过程中起重要作用［6］。脂类代谢紊乱、TNF-α在糖尿病视网膜病变发病机制中的作用已有相关研究报道［7］。同时TNF-α对介导多种细胞因子发挥炎症早期的免疫反应具有重要作用［8］。TNF-α可升高视网膜血管的通透性，刺激血管外基质的过量产生和血管细胞的增殖，导致眼内新生血管形成。有报道表明，TNF-α浓度高低与病程和疾病严重程度呈正相关［9］。

    糖尿病发生发展过程中TNF-α升高的机制可能是由于在高血糖环境下，代谢发生异常，导致视网膜毛细血管结构和功能破坏，造成视网膜的损害，使视网膜长期处于缺血缺氧状态，这种缺氧刺激打破了视网膜血管生长因子和抑制因子之间的平衡，使TNF-α等强有力地促血管生成因子增加。有研究认为，增加抗TNF-α抗体可抑制TNF-α活性，有可能为糖尿病视网膜病变治疗开辟一个新途径。

    APS能改善糖尿病视网膜病变，其机制可能与其降低血糖及血脂，改善胰岛素抵抗，抑制视网膜局部细胞因子TNF-α的表达有关。

【参考文献】
  　　［1］Robert,NF.糖尿病视网膜病变［J］.中国处方药，2004，4(25)：53.

　　［2］Wu Y, Ou-Yang JP, Wu K,et al. Hypoglycemic effect of Astragalus polysaccharide and its effect on PTP1B［J］. Acta Pharmacol Sin,2005,26:345.

　　［3］Ni Y,Su Q,Liu X,Et Al.Experimental Study Of Optimized Techniques Of Water Decotion Extraction Of Astragalus Polysaccharide［J］.Zhong Guo Zhong Yao Za Zhi ,1998,23:284.

　　［4］Tetsuya Shiuchi, Tai-Xing Cui, Lan Wu, et al. ACE Inhibitor Improves Insulin Resistance in Diabetic Mouse Via Bradykinin and NO［J］. Hypertension, 2002, 40:329.

　　［5］Bonora E, Targher G, Alberiche M, et al Homeostasis model assessment closely mirrors the glucose clamp technique in the assessment of insulin sensitivity studies in subjects with various degrees of glucose tolerance and insulin sensitivity［J］.Diabetes Care,2000,23:57.

　　［6］Hopkins KD, Brart DO , Russell-Jones DL , et al. Insulin-like growth factor binding protein-1 levels in diabetic proliferative retinopathy［J］. Horm Metab Res, 1993,25: 331.

　　［7］Limb GA , Chignell AH, Green W , et al. Distribution of TNF alpha and its reactive vascular adhesion molecules in fibrovascular membranes of proliferative diabetic retinopathy［J］. Br J Ophthalmol, 1996,80（4）:168.

　　［8］石一宁,惠延年.增殖性玻璃体视网膜病变的免疫机制［J］.国外医学·眼科学分册, 1995,19（4）:239.

　　［9］程金涛，周 芳.肿瘤坏死因子与血糖、血脂代谢紊乱在糖尿病视网膜病变中的作用［J］.中华眼底病杂志, 2004,20(4)：251.