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作者：周建衡， 李天骄， 洪振丰， 胡娟
【摘要】 目的建立粗叶悬钩子根部多糖的含量测定方法。方法利用苯酚-硫酸法显色，标准曲线在490 nm处分光光度法测定粗叶悬钩子根部多糖含量。结果回归方程：Y=0.8325X+0.022 3，r=0.999 8，测得粗叶悬钩子根多糖含量9.473%，平均回收率为99.69%，RSD=0.56%（n=6）。结论 该方法简便，精密度及重现性均较好，可用于粗叶悬钩子多糖的提取和含量测定。
【关键词】 粗叶悬钩子； 多糖； 苯酚-硫酸法; 分光光度法
Abstract：ObjectiveTo study the optimum extration process of polysaccharides from Rubus alceaefolius Poir. MethodsThe content of polysaccharids from Rubus alceaefolius Poir was determined by spectrophotometry at 490 nm．ResultsThe regression equation was Y=0.832 5×+0.022 3，r=0.999 8．The percent of polysaccharide in Rubus alceaefolius Poir was 9.473%.The average recovery rate was 99.69% and RSD was 0.56% (n=6)．ConclusionThe method is proved to be simple，accurate and reliable，and it can be used to extract and determine the polysaccharides from Rubus alceaefolius Poir.
Key words：Rubus alceaefolius Poir； Polysacharide； Determination
粗叶悬钩子为双子叶植物蔷薇科植物，粗叶悬钩子的根、叶均可入药，具有活血化淤、清热解毒之功效［1］，能清利湿热，并且使湿热内蕴所致的淤毒清除。据广州部队编写的《常用中草药手册》记载：“活血祛淤，清热止血，治急慢性肝炎、肝脾肿大、行军性血红蛋白尿、乳腺炎、外伤出血、口腔炎。”《广西中草药》中记载：“清热，消肿，止血，散淤。”在福建闽南安溪一带广泛应用于各型肝炎的治疗，有着良好的民间用药基础。本文采用苯酚-硫酸法测定粗叶悬钩子根部多糖的含量，得到满意的效果。
1 仪器与药品
粗叶悬钩子根部采自福建安溪，经福建中医学院中药系专家鉴定为双子叶蔷薇科悬钩子属植物Rubus alceaefolius Poir；D无水葡萄糖(批号：110833-200302，中国药品生物制品检定所);95%乙醇、浓硫酸均为国产分析纯，苯酚(临时配制)。UV-722分光光度计(上海分析仪器厂)；BP2110电子分析天平秤（德国赛多利斯公司）；DHG9240型电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；RK52A 型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。
2 方法与结果
2.1 葡萄糖标准溶液的配制 精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖50.52 mg，用蒸馏水溶解并定容到100 ml即为0.505 2 mg/ml的葡萄糖标准溶液。
2.2 苯酚溶液的配制 取苯酚100 g，加铝片0.1 g和NaHCO3 0.05 g，蒸馏，收集182℃馏份，称取7.5 g，加水150 ml溶解，置棕色瓶内放冰箱备用。
2.3 标准曲线绘制精密量取葡萄糖标准溶液0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 ml 置具塞三角烧瓶中，分别加蒸馏水使成2.0ml，再分别加入5%苯酚溶液6.0 ml，摇匀，然后逐滴缓慢加浓硫酸30.0 ml，充分摇匀、散热，再转移到50.0 ml容量瓶中，加蒸馏水定容至50.0 ml在30℃水浴恒温30 min，取出冷却至室温。另以蒸馏水同上操作为空白对照，在490 nm 处测定吸光度，绘制标准曲线，建立回归方程：Y=0.832 5X+0.022 3 r=0.999 8，线性范围2.02～20.2 μg/ml。
2.4 粗叶悬钩子多糖的提取及精制［2］ 将粗叶悬钩子根于ESP 350型粉碎机中粉碎呈粉末，取粗叶悬钩子粉50 g置于1 000 ml烧瓶中，加水（固液比1∶10）微沸回流3次，1 h/次，抽滤，合并提取液，蒸发至300 ml，加入无水乙醇使得醇浓度不低于70% ,析出沉淀 ,过滤得析出物，加水溶解再次抽滤得液体，用Sevag法除去蛋白（重复3次），加无水乙醇使醇浓度达80%以上 ,置冰箱中静置过夜 ，倾去上清液得沉淀，加无水乙醇搅拌后抽滤 ,得滤渣 ,滤渣用无水乙醇、丙酮洗涤多次，沉淀干燥得多糖纯品。 2.5 换算因子测定
精确称取65℃干燥恒重的粗叶悬钩子多糖20 mg，置100 ml容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，作为多糖储备液。精确量取多糖储备液0.10 ml，加水至1.00 ml，按测定标准曲线的方法测其吸光度值，根据标准曲线计算浓度。按下式计算换算因子：f=W/CD式中：W为多糖重量( μg)，C为测试液中据标准曲线计算得到的单糖浓度(μg·ml-1 )，D为多糖的稀释因子，测得f=2.595(n=6)。
2.6 稳定性实验取样品溶液、标准品溶液及精制多糖溶液各2.0 ml，照标准曲线制备项下方法，自“加苯酚试剂6.0 ml”起，依法测定吸收度，并分别于0，5，10，15，20，25，30，35，40，50，60 min测定，分析稳定性。结果样品溶液吸收度、标准品溶液吸收度、精制多糖溶液吸收度的RSD(%)分别为0.98，1.02，0.86，可知，样品液至少在1 h内测定是稳定可靠的。
2.7 精密度实验精密称取粗叶悬钩子多糖25 mg ，按照样品溶液制备和样品含量测定项下方法操作，测定吸光度，连续测定6次，平均值0.634， RSD为0.37%，表明精密度良好。
2.8 重现性实验取粗叶悬钩子多糖6份，按照样品溶液制备方法，分别制备6份质量浓度为0.1 mg/ml的溶液，按照样品溶液制备和样品含量测定项下方法操作，测定吸光度值，平均值0.645，RSD为1.66%，重现性良好。
2.9 样品含量的测定
精密称取粗叶悬钩子粉末25 mg，用80%乙醇浸泡过夜，再于索氏提取器中用80%乙醇回流2 h，抽滤，弃去滤液，残渣继续以蒸馏水回流提取2 h，抽滤，滤液连同滤纸反复洗至250 ml容量瓶中，定容，摇匀即得样品溶液。测定时，精密吸取样品液0.20 ml，加水至1.00 ml，按测定标准曲线同样方法测其吸光度值，按下式计算多糖含量(以粗多糖计)：多糖含量 =CDf×100/W。式中：C为样品溶液的葡萄糖的浓度(μg·ml-1 )，D为样品溶液的稀释因子，f为换算因子，w为样品的重量(μg)，测得结果为9.473% 。结果见表1。表1 样品中多糖的含量（略）
2.10 回收率实验
精密吸取样品液0.2 ml(6份)再分别精密加入等量的标准溶液，依样品测定方法测定吸光度，计算回收率平均值为99.69%，RSD为0.56%。结果见表2。表2 回收率实验（略）
3 讨论
本实验采用水提醇沉法提取粗叶悬钩子多糖，运用Sevage法除蛋白，纯化后的多糖以苯酚-硫酸比色法测定糖含量，此方法所需仪器通用、药品价格低廉，操作也方便，通过稳定性、精密度、重现性、加样回收率实验结果可以看出，此方法适合粗叶悬钩子多糖含量测定。采用紫外分光光度计检测，通过查阅大量文献选择490 nm处测定最大波长，从实验结果看，纯化后的粗叶悬钩子多糖含量为9.473%，测定结果为首次报道，可为该药的质量标准研究提供科学依据。
【参考文献】
［1］姚振生,杨武亮.江西省悬钩子属药用植物及利用建议［J］.中药材,1995,18(11)：551.
［2］李义奎.中药药理试验方法［M］.上海：上海科学技术出版社，1999：461. |
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发表于 2014-8-16 23:34:57
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