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作者：方建和，熊胜泉，颜冬梅，朱卫丰
【摘要】 目的采用高效液相色谱法测定消炎退热颗粒中咖啡酸的含量。方法十八烷基硅烷键合硅胶柱（Alltima,5 μm,4.6 mm×250 mm）；流动相：乙腈-0.4%磷酸（13∶87）；检测波长323 nm。结果咖啡酸进样量在0.0387～0.387 0 μg范围内线性关系良好；r=0.9998（n=6），平均加样回收率为100.56%（n=6）；精密度RSD=1.36%（n=6）。结论该方法操作简便、快速、准确。
【关键词】 高效液相色谱法； 消炎退热颗粒； 咖啡酸
Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC method for determination of Caffeic acid in Xiaoyan Tuire Granule.MethodsThe separation was carried out. ODS column(AIltima,5 μm，4.6 mm×250 mm) was used mobile phase of Acetonitrile- 0.4% Phosphoric acid (13∶87) and detection wavelength of 323 nm.ResultsThe Caffeic acid samples showed a good linear relationship at the range of 0.0387～0.387 0 μg(r=0.9998,n=6). The average recovery of the added sample was 100.56%(n=6) and method precision was RSD=1.36%(n=6).ConclusionThe method is simple, available and accurate
Key words：HPLC; Xiaoyan Tuire Granule; Caffeic acid
消炎退热颗粒处方来源于《中华人民共和国卫生部药品标准·中成药成方制剂第5册》［1］的消炎退热冲剂。全方由大青叶、蒲公英、紫花地丁、甘草等组成，具有清热解毒、凉血消肿，用于感冒发热、上呼吸道感染、咽喉肿痛及各种疮疖肿痛等。近年来药理实验研究表明蒲公英具广谱抗菌作用，临床用于各种急慢性感染，其化学成分研究分离出的咖啡酸具有广谱抗菌作用［2～4］。因此，本实验拟采用HPLC法测定成品中咖啡酸的含量，以控制消炎退热颗粒的质量。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
大连依利特高效液相色谱仪：uv200此外可变波长检测器，P200高压恒流泵。Metter M3电子天平，Metter AE100电子天平。
1.2 试剂
乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
1.3 对照品咖啡酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：0717200003，供含量测定用），使用前置硅胶干燥器中干燥至恒重。
2 方法与结果
2.1 色谱条件色谱柱为Alltima C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；乙腈0.4%磷酸（13∶87），检测波长323 nm，流速1.0 ml/min，柱温30℃。进样量20 μl。
2.2 对照品溶液的制备精密称取咖啡酸对照品适量，加甲醇制成每毫升中含8 μg的对照品溶液，避光保存，即得。
2.3 供试品溶液的制备取装量差异项下［5］的本品，研细，取约1 g，精密称定，加入50%甲醇10 ml，称定重量，超声处理（频率40 kHz，功率250 W）30 min，放冷至室温，用50%的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，取上清液过0.45 μm的微孔滤膜，取续滤液至棕色瓶中，避光保存，即得。
2.4 阴性对照实验取按处方及工艺制备的不含蒲公英原药材的样品，按供试品溶液的制备试验，结果在咖啡酸的峰位上未出现色谱峰，说明阴性对照无干扰。见图1。
2.5 线性关系的考察精密称取咖啡酸对照品9.675 mg置500 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，从中分别精密吸取1，2，4，6，8，10 ml至10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再从中分别精密吸取20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，测定其峰面积。结果见表1。表1 线性范围考察结果（略）
并以峰面积值A对进样量C进行回归，得标准曲线方程为A=3 160 809C-503 3，r=0.999 8。以峰面积值A为纵坐标，进样量C为横坐标作图，得一直线。结果表明，咖啡酸在0.038 7～0.387 0 μg内，样品进样量与峰面积线性关系良好。 2.6 精密度实验精密吸取对照品溶液（0.008 51 mg/g）20 μl，连续进样6次，测定峰面积值。结果见表2。表2 精密度实验（略）
2.7 重现性实验取同一批样品6份，按上述的方法分别制备供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，照前述色谱条件测定，结果见表3，实验结果表明，该法重现性良好。表3 重现性实验结果（略）
2.8 回收率实验精密称取已知含量的消炎退热颗粒［批号20050201，含量0.369 mg/袋（规格：5 g/袋）］适量，精密加入一定量的咖啡酸对照品，按质量标准中含量测定方法测定，计算回收率。结果见表4。表4 咖啡酸回收率实验结果（略）
2.9 样品测定实验按上述测定方法分别测定10批样品。结果见表5。表5 成品中咖啡酸含量测定结果（略）
结果表明，各批次消炎退热颗粒中的咖啡酸含量稳定。
3 讨论
蒲公英是常用的清热解毒中药，用于咽喉肿痛（急性扁桃体炎）疮疖，乳痈发热，也可用于热淋；现代药学及药理研究表明，蒲公英所含的绿原酸和咖啡酸具有广谱抗菌和消炎利胆作用。体外试验表明，蒲公英对金黄色葡萄球菌、变形杆菌、甲型链球菌、乙型链球菌均有明显的抑菌作用。因此，本研究将咖啡酸作为消炎退热颗粒质量控制的指标是可行的。在本次研究中我们首先参照《中国药典》测定本方大青叶中靛玉红成分的含量，因为本品工艺为水提醇沉工艺，靛玉红含量非常低（只有千万分之四），因此测定其含量意义不大。后改采用高效液相色谱法测定方中蒲公英中的咖啡酸的含量。为保证产品质量的均一性和临床用药的安全性及有效性，在对消炎退热颗粒质量研究的基础上建立了消炎退热颗粒中咖啡酸的含量测定方法。
对于在该品种的质量控制中建立以蒲公英中咖啡酸为含量测定指标的研究，未见文献资料报道。研究结果表明，该法方便、快速、准确，为制剂的质量控制提供了实验依据，可用于消炎退热颗粒的质量标准和质量控制，为全面控制产品质量提供了方法。
实验中发现磷酸的浓度对咖啡酸的峰形影响较大，0.1%的磷酸使主峰拖尾因子大于2.0。不同浓度的磷酸液对色谱行为的影响研究表明，0.4%的磷酸对咖啡酸峰分离较好，基线平稳，峰形尖锐、对称并达到基线分离，理论板数以咖啡酸峰计大于3000。
【参考文献】
［1］中华人民共和国卫生部民政局.中华人民共和国卫生部药品标准·中成药成方制剂，第5册［S］.1997，（5）：257.
［2］赵守训，杭秉倩.蒲公英的化学成分和药理作用［J］.中国野生植物资源，2001，31（1）：10.
［3］凌 云，鲍燕燕，张永林，等.兴安蒲公英的质量标准研究［J］.中草药，2000，31（1）：10.
［4］凌 云，范国强，肖 樾，等.中药蒲公英的质量标准研究［J］.中草药，1999，30（12）：897.
［5］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：244. |
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发表于 2014-8-16 22:56:59