高效液相色谱法测定复方银杏注射液中银杏总黄酮醇苷含量

amy54321 · 发表于 2014-8-16 22:56:30

   作者：于莲，钟尉方，刘娟，胡盛全

【摘要】  目的建立复方银杏注射液中银杏总黄酮醇苷的含量测定方法。方法高效液相色谱法， Zorbax-Extend－C18柱(5 μm ,4.6 mm ×150 mm )；甲醇0.4%磷酸溶液（45∶55）为流动相，流速为1.0 ml·min-1，柱温30℃，检测波长360 nm。结果槲皮素浓度在2.07～69.00 μg·ml-1，山柰素浓度在1.91～63.60 μg·ml-1，异鼠李素浓度在0.73～24.20 μg·ml-1范围内呈良好线性关系。结论该方法分析时间短、专属性好、稳定，可以作为复方银杏注射液质量控制方法。

【关键词】  复方银杏注射液；总黄酮；高效液相色谱法

　　Abstract：ObjectiveTo establish a  method for determining the flavonoids in Compound Ginkgo biloba Injection by HPLC. MethodsHPLC, Zorbax-Extend－C18 column (5 μm ,4. 6 mm×150 mm) was used. The mobile phase consisted of methanol0.4% phosphoric acid (45∶55)with  flow rate of 1.0 ml·min-1.The detection wavelength was set at 360 nm .The column temperature was set at 30℃ .ResultsThe linear range of quercetin, kaempferol and isorhamnetin were at the range of 2.07～69.00 μg·ml-1, 1.91～63.60 μg·ml-1  and 0.73～24.20 μg·ml-1. ConclusionThe  method  is rapid ,exclusive and  steady, and can be used for the quality control for the injection.

　　Key words：Compound Ginkgo biloba Injection；  Flavonoids； HPLC

复方银杏注射液是根据中医临床经验而开发的复方注射剂，由银杏叶提取物、丹参等药材组成，具有增加血管流量、改善血液循环、抑制血小板聚集、防止血栓形成等作用。其中银杏黄酮为主要成分，目前，国内外对银杏黄酮定量的方法有：络合分光光度法、库仑滴定法、薄层扫描法、高效液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法等［1］，参考相关文献［2，3］，比较各方法的优缺点，本实验选择建立了采用反相高效液相色谱法测定复方银杏注射液中黄酮含量的方法，为该复方银杏注射液质量标准的建立提供依据。

　　1  仪器及材料

　　1.1  仪器

　　Agilent 1100 Series：四元泵，真空在线脱气机，自动进样器，柱温箱，可变波长扫描紫外检测器，Agilent 色谱工作站。

　　1.2  药品及试剂

　　槲皮素对照品、山柰素对照品、异鼠李素对照品购于中国药品生物制品检定所（批号：10081-9905，110861-200405，110860-200406），甲醇（色谱纯，天津市科密欧化学试剂开发中心），磷酸（分析纯，天津市化学试剂一厂），水为娃哈哈饮用纯净水（杭州娃哈哈集团），复方银杏注射液（佳木斯大学化学与药学院提供，批号060414，060415，060416）。

　　2  方法及结果

　　2.1  色谱条件与系统适用性色谱柱Zorbax SB-C18柱(5 μm ,4. 6 mm ×150 mm  )，流动相为甲醇0.4%磷酸溶液（45∶55），检测波长为360 nm，流速1.0 ml·min-1，柱温30℃，进样量10 μl。经确认，出峰顺序为：槲皮素、山柰素、异鼠李素。理论板数按槲皮素峰计算不低于2 500，异鼠李素分离度大于1.5。

　　2.2  对照品溶液及标准曲线的制备

　　精密称取五氧化二磷干燥的槲皮素、山柰素、异鼠李素，甲醇溶解并定容作为贮备液，浓度为0.345，0.318，0.121 mg·ml-1，分别精密吸取3种对照品贮备液各0.06，0.1，0.3，0.7，1.0，2.0 ml，于10 ml量瓶中，甲醇定容，0.45 μm微孔滤膜过滤，作为对照品混合液，在上述色谱条件测定，记录峰面积积分值，分别以对照品的浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行回归计算，结果表明：槲皮素浓度在2.07～69.00 μg·ml-1范围内呈良好线性关系，回归方程：A=57.375C-14.757，相关系数r=0.999 7；山柰素浓度在1.91～63.60 μg·ml-1范围内呈良好线性关系，回归方程：A=50.194C+15.311，相关系数r=0.999 6；异鼠李素浓度在0.73～24.20 μg·ml-1范围内呈良好线性关系，回归方程：A=54.857 0C+1.230 9，相关系数r=0.999 4。

　　2.3  供试品溶液的制备

　　精密吸取复方银杏注射液5 ml于圆底烧瓶中，加甲醇10 mol/L盐酸溶液（4∶1）混合液25 ml，恒温回流1.5 h，冷却，转移至50 ml量瓶中，并加甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

　　2.4  专属性实验

　　取不含银杏叶提取物的阴性对照注射液，按供试品溶液的制备方法，制备阴性对照溶液，分别取供试品溶液、对照品溶液与阴性对照溶液，相同色谱条件进样测定，测定结果见图1。检测结果证实：样品中槲皮素、山柰素、异鼠李素与其它组分分离较好,且阴性对照在相应的保留时间无干扰。　　2.5 精密度实验

　　取槲皮素、山柰素、异鼠李素浓度分别为10.35，9.54，3.63 μg·ml-1的对照品混合液，在上述色谱条件下连续进样6次。槲皮素、山柰素、异鼠李素的峰面积的RSD分别为0.98％，0.90％，1.00％。

　　2.6  重复性实验

　　按供试品的制备方法，取同一批号样品注射液6支制备6份复方银杏注射液的供试品溶液，上述色谱条件下测定，槲皮素、山柰素、异鼠李素的峰面积的RSD分别为2.24％,2.99％,2.87％。

　　2.7  稳定性考察取新制备的复方银杏注射液供试品溶液，按上述色谱条件分别于0，1.5，4，6，24 h测定，槲皮素、山柰素、异鼠李素的峰面积RSD分别为1.67％,1.18％,6.08％，结果认为供试品中槲皮素和山柰素在24 h内稳定性良好，而异鼠李素在24 h已不稳定，因此，建议检测样品应在水解处理后的6 h之内完成。

　　2.8  加样回收率

　　实验取已测定含量的复方银杏注射液水解样品6份及浓度相当的对照品溶液（槲皮素浓度12.72 μg·ml-1，山柰素浓度9.54 μg·ml-1，异鼠李素浓度1.21 μg·ml-1），设置程序进样，10 μl样品加10 μl对照品，二倍体积混匀进样，相同色谱条件测定，计算银杏总黄酮醇苷平均收率为101.23％，RSD为1.43％。

　　2.9  样品含量测定

　　按供试品的制备方法，取3批次样品于相同色谱条件进样测定并计算。结果见表1。表1  复方银杏注射液中银杏黄酮醇苷含量测定结果（略）

　　3  讨论

以《中国药典》色谱条件［4］为参考，对供试品和对照品进行高效液相色谱条件筛选，实验证实，《中国药典》条件基本适用于本复方制剂，复方中的其它成分在该色谱条件下无干扰，而且适当增加柱温有利于缩短分析时间，提高山柰素和异鼠李素的分离效果。实验还对供试品的水解条件进行了细致的摸索，最终确定的水解条件和色谱条件可以作为该复方银杏注射液中银杏总黄酮醇苷的含量测定方法。

【参考文献】
  　　［1］姜国芳，谢宗波，乐长高.银杏叶黄酮类化合物的研究进展［J］.时珍国医国药，2004，15（5）：306.

　　［2］王淑君,候薇,张天政，等. HPLC法测定银杏叶缓释胶囊中总黄酮的含量［J］.中草药, 2004,35(2):163.

　　［3］杜安全，王先荣，周正华，等.银杏叶黄酮苷的HPLC法分析水解条件［J］.安徽医药，2001，5（3）：164.

　　［4］国家药典委员会.中国药典［S］.北京：化学工业出版社,2005：220.

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