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[药学] 益肾通络颗粒澄清工艺研究

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发表于 2014-8-16 22:49:39 | 显示全部楼层 |阅读模式
     作者:湛琦,刘友平,王继森,石宇华,俞佳, 李准

【摘要】  目的研究益肾通络颗粒ZTC1+1澄清工艺。方法ZTC1+1Ⅱ型澄清剂应用于益肾通络颗粒的澄清工艺,以丹酚酸B、多糖的保留率及固形物的降低率为评价指标,优选药液浓缩比、絮凝温度及澄清剂用量,并与醇沉法进行比较。结果运用ZTC1+1Ⅱ型澄清剂除杂能有效降低收膏率,且有效成分保留率均较醇沉法高。结论ZTC1+1Ⅱ型澄清剂对益肾通络颗粒的除杂具有可行性。

【关键词】  益肾通络颗粒; ZTC1+1澄清剂; 澄清工艺

  Abstract:ObjectiveTo study the ZTC1+1 clarification procedure of Yishentongluo granule. Methods ZTC1+1 Ⅱ nature clarifying agent was applied to the clarification process of Yishentongluo granule. The optimum clarifying temperature, the density of decoction and the content of ZTC1+1 nature clarifying agent were evaluated according to the content of salvianolic acid B、total polysaccharidet and the yield of dried extract and its effect were compared with alcohol sedimentation. ResultsBesides reducing the yield of dried extract, the ZTC1+1 was more effective than alcohol sedimentation in retaining the active compound. ConclusionThe ZTC1+1 Ⅱ nature clarifying agent used in the clarification process of Yishentongluo granule is feasible.

  Key words:Yishentongluo Granule;  ZTC1+1 nature clarifying agent;  Clarification process

    益肾通络颗粒为丹参、茯苓、白术等药组成的中药复方制剂,具有益气补肾通络、清利湿热等功效,临床主要用于肾病综合征。本处方临床疗效确切,为方便临床使用,拟改汤剂为颗粒剂。由于原制备工艺为水煎,在提取有效成分的同时,大量的淀粉、鞣质等杂质随之溶出,使处方服用量较大。为保留有效成分且降低收膏率,本实验对制剂的除杂工艺进行了研究。

    前期研究表明本方药液含大量多糖,且为有效部位,传统的水提醇沉除杂方法导致多糖大量损失。ZTC1+1澄清剂是近年来出现的新型澄清剂,用于中药制剂的除杂已有报道[1~3],同时该澄清剂对中药的中的苷类、黄酮类、有机酸、生物碱、皂苷类、萜类、多糖、氨基酸等不影响。根据本方的特点,选择ZTC1+1Ⅱ型澄清剂进行除杂。

  1  仪器与试药

    LC10ATvp高效液相色谱仪,岛津CLASSVP工作站,SPD10ATvp检测器(岛津香港公司);TL500台式离心机(上海市离心机械研究所);BP121D电子分析天平(十万分之一,德国Sartorius股份公司);ZTC1+1Ⅱ型澄清剂购自天津正天成澄清技术有限公司;丹参酚酸B对照品(含量测定用,批号:11562200403)购自中国药品生物制品检定所;甲醇为色谱纯,其它试剂均为分析纯。

  2  方法与结果

  2.1  澄清剂的配制称取A组分7.2 g,加入720 ml去离子水,溶胀24 h,搅拌,配制成1%粘胶液。称取B组分14.4 g,加入1 440 ml醋酸溶液,溶胀24 h,搅拌,配制成1%粘胶液。

  2.2  药液的制备按处方量称取600 g药材,加11倍量水,煎煮3次,2 h/次,滤过,合并水煎液,浓缩药液至3 000 ml。

  2.3  评价指标的选择及测定丹参为本方君药,其水溶性有效成分丹参酚酸B含量较高,且具有抗血栓、抗脂质过氧化、抗糖尿病型肾病等作用,与本方的功能主治相符;同时本方药液所含的大量多糖具有增强机体免疫功能、调血脂、降血糖的作用,为有效部位。故以有效成分丹参酚酸B、多糖的保留率及固形物的降低率为评价指标综合考察本复方制剂的澄清工艺。

  2.3.1  丹参酚酸B含量的测定

  2.3.1.1  色谱条件色谱柱:Hypersil ODS 色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇水(42∶58),水加甲醇至pH=2.5;流速:0.6 ml/min;检测波长:281 nm;柱温:30℃;理论板数按丹参酚酸B峰计算应不低于2 000。

  2.3.1.2  标准曲线的制备精密称取105℃干燥至恒重的丹参酚酸B对照18.80 mg,置10 ml量瓶中,加70%甲醇溶液解并稀释至刻度,摇匀,即得。精密吸取上述对照品溶液0.2,0.5,1.0,1.5,2 ml,分别置于10 ml量瓶中,加70%甲醇稀释至记得度,摇匀。分别精密吸取10 μl注入高效液相色谱仪,以对照品浓度为横坐标X(μg/ml),峰面积为纵坐标Y,绘制标准曲线,得回归方程Y=19 142X-16 681, r=0.999 85。表明丹参酚酸B浓度在37.6~376 μg/ml范围内与峰面积线性关系良好。

  2.3.1.3  供试品溶液的制备及测定将2.4.1,2.4.2,2.4.3项下的药液于离心机中5 000 r/min离心20 min,取上清液置100 ml量瓶中加蒸馏水水稀释至刻度,摇匀,微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl,注入高效液相色谱仪,测定。

  2.3.1.4  阴性对照溶液制备及测定按处方比例,取除丹参以外的其它药味,同供试品制备方法制备阴性对照溶液。结果在丹参酚酸B的出峰位置处无其它干扰。  2.3.2  多糖含量的测定

  2.3.2.1  测定波长的选择分别移取经0.2%蒽酮浓硫酸显色后的葡萄糖对照口溶液及样品供试液,以0.2%蒽酮浓硫酸溶液作空白,于400~700 nm波长进行扫描,对照品溶液及样品供试液均在(625±1) nm波长有最大吸收。

  2.3.2.2  标准曲线的制备取105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品适量,精密称定,置50 ml量瓶中,加蒸馏水稀释至刻度,摇匀,即得(每毫升含1.078 mg葡萄糖)。精密吸取上述对照品溶液1,2,4,6,8,10 ml,分别置50 ml量瓶中,加蒸馏水稀释至刻度,摇匀。分别吸取上述溶液5 ml置量瓶中,加10 ml 0.2%蒽酮浓硫酸显色,摇匀,置沸水中加热6 min,置冰水浴中速冷,以试剂为空白,于625 nm处测定吸光度。以浓度(mg/ml)为横坐标X,吸光度为纵坐标Y,绘制标准曲线,得回归方程Y=9.550 4X+0.157 1,r=0.999 5。表明多糖浓度在0.021 56~0.215 6 mg/ml范围内线性关系良好。

  2.3.2.3  供试品测定方法吸取2.3.1.3项下定容后的药液2 ml药液置250 ml量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀。取5 ml置量瓶中,加10 ml 0.2%蒽酮浓硫酸显色,置沸水加热6 min,速冷,以试剂为空白,于625 nm处测定吸光度。

  2.3.3  浸出物的测定取定容后的药液25 ml,置干燥至恒重的蒸发皿中,水浴蒸干,烘箱105℃干燥3 h,称重。

  2.4  澄清工艺条件的考察据文献报道,影响ZTC1+1澄清工艺的主要因素有加B组分时的絮凝温度、药液浓缩比及澄清剂用量[4],故本次研究分别对这3个因素进行考察。

  2.4.1  絮凝温度的考察量取原药液100 ml 3份,分别将药液加热至60,70,80℃,保温,搅拌分散加入3 ml 1%B组分,之后每隔30 min搅拌`1次,2 h后,将药液温度降至60℃,同法加入1.5 ml 1%的A组分,将药液温度升至80℃,保温30 min即可。静置4 h,测定。结果见表1。70℃时综合评分最高,故絮凝的最佳温度选择70℃。表1  絮凝温度考察结果(略)

    综合评分=丹酚酸B保留率×100×0.4+多糖保留率×100×0.4+固形物减少率×100×0.2

  2.4.2  药液浓缩比的考察量取原药液100 ml 5份,分别稀释至生药体积比(g/ml)为1∶5,1∶7.5,1∶10,1∶15,1∶20,将药液温度加热至70℃,保温,加入3 ml B组分,其它操作同“絮凝温度的考察项下”。结果见表2。生药体积比为1∶7.5时综合评分最高。表2  药液浓缩比考察结果(略)

  2.4.3  澄清剂用量的考察量取原药液100 ml 3份,分别稀释至生药体积比为1∶7.5,将药液温度加热至70℃,保温,B组分的加入量分别为2%,3%,4%药液体积,A组分的加入量为相应B组分的一半,具体操作同“絮凝温度的考察项下”。结果见表3。加入2%B组分时综合评分最高。表3  澄清剂用量考察结果(略)

  2.4.4  醇沉与澄清剂工艺比较量取药液100 ml 3份,加入乙醇,使含醇量分别达到30%,50%,70%,静置过夜,滤过,滤液浓缩至100 ml,分别测定各指标。结果见表4。

    取相同药液100 ml 3份,分别稀释至生药体积比为1∶7.5,搅拌分散加入2 ml B组分,之后每隔30 min搅拌1次,2 h后,将药液温度降至60℃,同法加入1 ml的A组分,将药液温度升至80℃,保温30 min即可,静置24 h,依照2.3项下方法测定,结果见表4。表4  醇沉与澄清剂工艺比较(略)

    由上述结果可知,运用不同浓度的醇能有效地降低收膏率,但造成有效部位多糖的大量损失;澄清剂工艺既能保留多糖及丹参酚酸B,又能使收膏率降低30%。

  3  讨论

  3.1  在研究丹参酚酸B含量测定色谱条件时,曾考察甲醇乙腈甲酸水系统、乙腈甲酸水系统、甲醇甲酸水系统作流动相[5],结果采用甲醇水(42∶ 58),水加甲醇pH=2.5时,供试品色谱中丹参酚酸B的分离度及理论塔板数较好。

  3.2  文献报道丹参酚酸B在水溶液中低于质量浓度(1 mg/ml)时不稳定,在高质量浓度、低pH值、低温条件下基本稳定[6],经考察本供试液澄清前丹参酚酸B的含量在3 d内稳定,此后含量明显降低。

  3.3  本实验多糖的测定方法采用比色法,该法的缺点是不能排除还原性杂质(包括单糖)的干扰,在以后的研究中将完善多糖的含量测定方法,以准确地反映药液中有效部位多糖的含量。

  3.4  现代中药制剂一般采用水提醇沉、澄清剂、大孔树脂、膜分离、超速离心等方法进行除杂,文献报道澄清剂主要去除中草药中的鞣质、蛋白质、叶绿素、油脂、蜡树脂、淀粉等成分,且对有效成分如苷类、黄酮类、有机酸、生物碱、皂苷类、萜类、多糖、氨基酸等不影响[3]。实验研究并确定了ZTC1+1Ⅱ型澄清剂除杂的工艺参数,同时与水提醇沉除杂工艺进行了对比。结果表明运用ZTC1+1Ⅱ型澄清剂除杂收膏率平均降低33.51%,多糖及有效成分丹参酚酸B的保留率分别为94.02%,84.31%,均较传统水提取醇沉法高,且澄清后的药液澄明度较高,为进一步喷雾干燥奠定了基础,此外该工艺还具有操作简便、成本低廉的特点,ZTC1+1Ⅱ型澄清剂用于本制剂的除杂具有可行性。

【参考文献】
    [1]王 冕,张宏宇,刘新彦,等.澄清剂ZTC在中药制剂中的应用[J].中国新医药,2003,2(7):76.

  [2]张咏梅,赵振彪,解淑阁,等.ZTC1+1Ⅲ型天然澄清剂在中风安口服液制备中的应用[J].中成药,2004,26(4):337.

  [3]颜 红.天然澄清剂在中药水提液澄清工艺中的应用[J].中医药导报,2005,11(1):80.

  [4]李朝兴.新一代纯天然澄清剂ZTC系列天然澄清剂[J].离子交换与吸附,1994,10(6):565.

  [5]国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部[S].北京:化学工业出版社,2005:52.

  [6]岳喜典,曲桂武,李桂生,等.丹参酚酸B在水溶液中的稳定性研究[J].中草药,2005,36(2):205.
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