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【摘要】 目的建立一种测定桑枝中多糖含量的方法。方法采用水提醇沉法对桑枝中的多糖进行提取，用Sevag法等进行纯化，蒽酮-浓硫酸法测定多糖的含量。结果回归方程：A=0.024 94C+0.057 1，r=0.999 5，线性范围为0.08～0.4 μg·L-1。桑枝多糖的含量为18.74%（RSD=2.1%)，平均回收率为98.6%，RSD=1.4%。结论 该法简便、快速、重现性好，为桑枝的质量控制提供了方法。
【关键词】 桑枝； 多糖； 蒽酮浓硫酸法
Abstract：ObjectiveTo establish a kind of determining method of contents of polysaccharides in Mulberry Twig. MethodsThe polysaccharide in Mulberry Twig was extracted with water and ethanol precipitation. Anthrone-sulfonic acid was applied to analysis of the contents of polysaccharides. ResultsThe content of polysaccharides in Mulberry Twig was 18.74 mg/g, average recovery was 98.6%, RSD=1.4%. ConclusionThe results showed that this method is simple, specific and accurate. It provides a method for mass control of Mulberry Twig.
Key words：Mulbery Twig； Polysaccharide； Anthrone-sulfonic acid method
桑枝为桑科植物桑Morus alba L.的嫩枝，Mulberry Twig桑枝：又名桑条，桑枝的药用历史悠久，《中国药典》记载为祛风湿，利关节的常用药，用于治疗肩臂关节酸痛麻木［1］。临床应用于关节肿痛、手足麻木、风湿痹痛、瘫痪等多种疾病。多糖是多种中草药的有效成分之一，多糖有十分广泛的生物活性，能促进人体的免疫功能，具有抗肿瘤、抗病毒、抗突变、抗辐射及降血压等功效［2，3］。对桑枝中多糖的研究具有重要的意义。有关桑枝多糖的化学研究，未见报道。为有效开发利用桑枝药材资源，揭示桑枝多糖与药效的关系，本文采用超声提取法提取桑枝中的多糖，蒽酮-浓硫酸法测定多糖的含量［4，5］。
1 仪器与试剂
TU1800SPC型紫外分光光度计；超声波清洗器；TOL40B离心机（上海安亭科学仪器厂）。无水葡萄糖、乙醇、蒽酮、浓硫酸、氯仿、正丁醇均为分析纯。蒽酮浓硫酸试剂（0.2 g∶100 ml）。桑枝，200405采于新疆喀什。
2 方法
2.1 桑枝多糖的提取称取干燥至恒重并过40目筛的桑枝粉末100 g，加水适量，于95℃时超声提取30 min，过滤，滤渣于95℃超声再提取30 min，相同条件下提取3次，合并提取液，于旋转蒸发仪上浓缩至100 ml，在其中加95%乙醇至含醇量为85%，4℃时静置过夜。于40 000 r/min的条件下离心分离，离心后的沉淀物加少量热水溶解，再加95%乙醇至含醇量为85%，静置过夜，离心分离，得粗多糖。
2.2 多糖的精制植物粗多糖中一般含有蛋白质，以游离态和结合态存在，将蛋白酶法和Sevag法结合起来，不但可脱去游离蛋白，而且可脱去结合蛋白质。将上述得到的粗多糖溶于水，加入2%木瓜蛋白酶，60℃时酶解2 h，再用Sevag法（氯仿∶正丁醇=4∶1）除蛋白15次。加1%活性碳脱色，抽滤，加入95%乙醇使含醇量达85%，4℃时静置过夜，离心分离。沉淀物冷冻干燥，即得精制淡黄色的桑枝多糖。
将多糖溶液进行200～400 nm紫外区扫描，无特征吸收峰，茚三酮反应为阴性，说明桑枝多糖中的蛋白质已除干净。
3 结果与讨论
3.1 标准溶液的制备精密称取葡萄糖对照品0.100 0 g，用蒸馏水溶解并定容至100 ml，配成浓度为1.000 mg/ml的标准储备液。
3.2 标准曲线的绘制精密吸取上述葡萄糖标准储备液0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 ml于100 ml的容量瓶中，用蒸馏水定溶至刻度。分别取2.0 ml于25 ml具塞试管中，加蒽酮-浓硫酸试剂4 ml，放入沸水浴中加热8 min，迅速冷却至室温。于620 nm处测定吸光度值，计算回归方程：A=0.024 94C+0.057 1，r=0.999 5，线性范围为0.08～0.4 μg·L-1。
3.3 换算因子的测定精密称取精制后的桑枝多糖0.010 0 g，用少量热蒸馏水溶解后，定溶于100 ml容量瓶中，摇匀。精密吸取此溶液2 ml于25 ml具塞试管中，加蒽酮-浓硫酸试剂4 ml，沸水浴中加热8 min，迅速冷却至室温，于620 nm处测定吸收度。根据标准曲线计算浓度，再按下式计算换算因子，得f=9.618 9。 f=WCD
式中W为多糖质量（mg），C为多糖浓度（μg·L-1），D为稀释因子。
3.4 精密度实验精密吸取对照品溶液1.0 ml，10份，于25 ml具塞试管中，加蒽酮-浓硫酸4 ml，沸水浴中加热8 min，迅速冷却至室温。于620 nm处测定吸光度值。结果吸光度的RSD=1.4%。
3.5 样品溶液的测定准确称取过40目筛的干燥桑枝粉末约0.5 g（4份），置于100 ml容量瓶中，加水适量，在95℃水温中超声提取30 min，过滤于另一100 ml容量瓶中，洗涤滤渣多次，用水稀释至刻度。精密吸取样品溶液5.0 ml，置100 ml容量瓶中加水稀释至刻度。将稀释后的溶液精密吸取2.0 ml置25ml具塞试管中，加入蒽酮－浓硫酸试剂4 ml，沸水浴中加热8 min，迅速冷却至室温，于620 nm处测定吸光度值，代入回归方程求多糖浓度C。根据下式计算含量。
含量=CDfW式中W为样品质量，C为糖浓度，f为换算因子，D为稀释因子。由上式可算出桑枝多糖的含量为18.74%(RSD=1.4%)。
3.6 回收率实验精密称取桑枝样品约0.5 g（6份），分别加入不同量的精制后的桑枝多糖溶液，按3.5项下操作，测得平均回收率为98.6%，RSD=1.4%。4 讨论
4.1 实验条件的选择蒽酮-硫酸比色法是测定多糖含量较为经典有效的方法之一。对于硫酸的用量，经实验对比认为硫酸占总体积62.5%以上时，使实验的重现性、稳定性及回收率等较好。
关于多糖的干燥，许多文献都是采用真空干燥和冷冻干燥。在真空干燥器中放入五氧化二磷或固体氢氧化钠等干燥剂，保持高度真空度，可提高干燥速度。也有文献报道用60℃烘干。我们经过多次实验证实，干燥多糖不能加热，否则会使多糖变成黏稠的半固体状态；同样也不能室温下缓慢干燥，这样也会使多糖变成难溶的角质块状物。
4.2 乙醇的浓度对多糖提取率的影响取5月份的桑枝粉200 g，于95℃时超声提取3次（30 min/次），合并滤液，于旋转蒸发仪上浓缩至450 ml，将其分为9份，加入乙醇，使含醇量分别为30%，40%，50%，60%，70%，75%，80%，85%，90%，静置过夜，离心分离，沉淀用95%乙醇、丙酮、乙醚等洗涤多次，60℃真空干燥。依法测定含量，求提取率，见图1。
实验发现含醇量达85%时，多糖的含量较高，本实验选含醇85%为醇沉条件。
4.3 提取温度的选择 固定提取时间为30 min，分别在60，70，80，90，95，100℃超声提取1次。结果见图2。
从图2可知，提取温度为95℃时，提取率较高，本实验选95℃为超声提取温度。
4.4 提取时间的选择
确定提取温度为95℃，提取1次，比较超声提取10，20，30，40，50 min时对提取率的影响。见图3。
4.5 提取次数的选择
上述实验表明，提取时间为30 min，提取温度为95℃为最佳提取条件，在此条件下，研究了不同提取次数对提取率的影响。结果证明，提取3次，效率最高。
【参考文献】
［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：210.
［2］谭周进，谢达平. 多糖的研究进展［J］.食品科技，2002，5：33.
［3］周 靓，蒙义文. 多糖及其衍生物抗病毒作用的研究进展［J］.应用与环境生物学报，1997，3（1）：82.
［4］刘晓河，梁惠花，谭晓红.茵陈中多糖的含量测定［J］.中草药，2003，34（6）：19.
［5］张思巨，张淑运，王 岚，等.大黄多糖的研究［J］.中国中药杂志，1993，18（11）：679. |
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发表于 2014-8-16 22:46:13
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