SPEHPLC法测定小柴胡片中柴胡皂苷a的含量

amy321 · 发表于 2014-8-3 15:30:39

【摘要】  目的建立小柴胡片中柴胡皂苷a的含量测定方法。方法采用HPLC法，以固相萃取进行样品前处理，以Kromasil 5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱；以甲醇水（体积比75∶25）为流动相；检测波长为203 nm。结果柴胡皂苷a的线性关系良好，回归方程：A=358.09m-7.6102，r=0.9991；平均加样回收率98.2%，RSD为1.92%。结论采用固相萃取能够有效消除杂质对柴胡皂苷a含量测定的影响；本法操作简便，重复性好，回收率高，可作为小柴胡片质量控制的有效方法。

【关键词】  小柴胡片；柴胡皂苷a；高效液相色谱法；固相萃取

　　柴胡片收载于中国药典2005年版一部中，由柴胡、半夏、黄芩等七味药组成，具有解表散热、疏肝和胃之功效，用于治疗外感病、邪犯少阳证有较好疗效。中国药典中以黄芩、甘草的TLC鉴别和黄芩苷的含量测定来控制本品的质量［1］，而对于本品中的君药，用量最大并起主要作用的柴胡却没有质量控制指标。

　　柴胡中柴胡皂苷a具有抗炎、调节免疫等作用［2］，是小柴胡片治疗外感病，邪犯少阳证的物质基础。因此，建立本品中柴胡皂苷a的含量测定方法，有助于更好的控制本品的质量。但柴胡皂苷a的紫外吸收波长在203 nm，处于紫外末端，在测定时受杂质干扰严重。固相萃取（SPE）是一种新的样品前处理技术，近年来已经应用于中药含量测定方法研究［3-5］，但还未见有将此方法应用于柴胡皂苷a的含量测定的文献报道。本文采用这种样品前处理技术，有效地消除了本品中杂质对柴胡皂苷a测定的影响，保证了测定结果的准确性，具有操作简便，节约时间，回收率高的优点，可用于小柴胡片的质量控制。

　　1  仪器与试药

　　Agilent 1100 Series高效液相色谱仪（Agilent Technologies,USA），Agilent Chem Station 4.0 色谱工作站；Supelclean ENVI18 SPE C18小柱（500 mg/3 mL，美国），Satorius 电子分析天平（Sartorius Co.Ltd.Germany）；艾科普纯净水发生器。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余所用试剂均为分析纯。

　　柴胡皂苷a对照品（批号：110777-200301，供含量测定用）购至中国药品生物制品检定所。小柴胡片（A厂，070102，070205，070408）。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件与系统适用性

　　以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Kromasil 5C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇水（体积比75∶25）为流动相；流速为0.8 mL/min；检测波长为203 nm。理论塔板数按柴胡皂苷a峰计算应不低于5000。对照品图谱、样品图谱、阴性对照图谱见图1。

　　A.柴胡皂苷a对照品； B.小柴胡片； C.阴性对照  1.柴胡皂苷a

　　图1  HPLC色谱图（略）

　　Fig.1  HPLC chromatograms

　　2.2  对照品溶液的制备

　　精密称取柴胡皂苷a对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，摇匀，即得。

　　2.3  供试品溶液的制备

　　取小柴胡片20片，研细，混匀，取约4 g，精密称定，加5%（体积分数）氨水甲醇60 mL，回流提取2次，合并2次提取液，滤过。水浴挥干，残渣加水10 mL溶解，加水饱和正丁醇萃取4次，每次20 mL，合并正丁醇液，加氨试液洗涤2次，每次20 mL，弃去氨洗液。正丁醇液蒸干，残渣加水5 mL使溶解，加于已处理好的C18微柱（先用甲醇10 mL冲洗，再用水10 mL冲洗）上，分别用水10 mL，80%(体积分数）甲醇20 mL洗脱，收集80%（体积分数）甲醇洗脱部分，蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

　　2.4  线性关系考察

　　精密吸取上述对照品溶液8、10、12、16、20、25、30 μL，注入液相色谱仪，测定。以峰面积(A)为纵坐标，以进样量(m)为横坐标，进行线性回归，得回归方程：A=358.09m-7.6102，r=0.9991。结果表明，在4.02～15.06 μg 范围内线性关系良好。

　　2.5  稳定性试验

　　取同一份供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24 h注入液相色谱仪，测定,结果峰面积的RSD为1.05%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。　2.6  重复性试验

　　取同一批号（070102）样品6份，按“2.3”项下制备成供试品溶液，进样测定，结果6份供试品含量的RSD为1.04%。表明本法的重复性良好。

　　2.7  加样回收试验

　　取已知含量的小柴胡片粉末6份，按照供试品中柴胡皂苷a的量与对照品加入量1∶1的比例加入柴胡皂苷a对照品，分别制备供试品溶液，注入液相色谱仪，测定。以实测值与对照品加入量计算回收率。结果6份供试品的平均回收率为98.24%，RSD为1.92%，见表1。表明本方法回收率良好。

　　表1  柴胡皂苷a加样回收试验结果（略）

　　Tab.1  Recovery test of Saikosaponia a

　　2.8  样品测定

　　取3批样品，照“2.3”项下制备成供试品溶液后，测定。结果3个批号070102、070205、070408样品所测得的柴胡皂苷a含量分别为0.38、0.51、0.69 mg/片。

　　3  讨论

　　3.1  小柴胡片处方中有黄芩、党参、甘草等药材，既含有大量水溶性杂质，又含有较多的亲脂性杂质。在提取柴胡皂苷a提取时也会提取出很多杂质，干扰测定结果的准确性。本文采用与液相色谱柱填料相近的C18小柱进行固相萃取，分别以水洗脱，除去水溶性杂质,再以80%(体积分数）甲醇洗脱柴胡皂苷a，而将大量的亲脂性杂质保留在小柱上，从而有效地除去杂质的干扰，保证了测定结果的准确性。

　　3.2  C18 SPE小柱有100 mg/3 mL，500 mg/3 mL等多种规格。本文考察了100 mg/3 mL与500 mg/3 mL两种规格对含量测定的影响，结果采用100 mg/3 mL小柱时，供试品的回收率只有72%左右，而采用500 mg/3 mL小柱时，回收率达到98.24%。可见，SPE小柱的吸附容量会影响含量测定结果的准确性。可能是由于样品中杂质的竞争性吸附导致柴胡皂苷a在100 mg/3 mL小柱上吸附不完全，而500 mg/3 mL小柱由于吸附容量增大，能够完全吸附柴胡皂苷a，所以后者的回收率要明显高于前者。提示在采用SPE小柱进行样品前处理时，要充分考察吸附容量对含量测定的影响。

　　3.3  从本文结果看，不同批次小柴胡片中柴胡皂苷a的含量相差较大。据文献报道，不同产地柴胡药材中，柴胡皂苷a的含量相差1～5倍［6,7］，这可能是导致小柴胡片中柴胡皂苷a含量差异的主要原因。因此，有必要进行药材的GAP规范化种植，从而在原料上保证小柴胡片成品批间质量的一致性。

【参考文献】
  　　［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2005年版一部［S］.北京：化学工业出版社，2005：357.

　　［2］祖宁，李平.柴胡皂苷的生理作用及临床意义［J］.中国中医药信息杂志，2005，12（4）：94-96.

　　［3］沈红,钱大玮,段金廒,等.SPEHPLCELSD法测定黄芪中黄芪甲苷的含量［J］.现代中药研究与实践，2006，20（1）：45-46.

　　［4］朱炳辉,梁艺英,方继辉.消炎利胆片中脱水穿心莲内酯的SPEHPLC法测定［J］.中成药,2006,28(2): 191-194.

　　［5］林华,吴钉红.高丽参注射液SPEHPLC指纹图谱初步研究［J］.中药材,2006,29(8):846-849.

　　［6］白雪梅,田嘉铭,王德宝.HPLC测定不同产地柴胡中柴胡皂苷a及柴胡皂苷d的含量［J］.中成药，2006，28（3）：440-441.

　　［7］林东昊，茅仁刚，王智华,等.23种国产柴胡属植物中柴胡皂苷a、c、d含量的RPHPLC测定［J］.药物分析杂志，2004，24（5）：479-483.

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