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【摘要】 目的建立五妙水仙膏的质量标准。方法采用薄层色谱法对处方中黄柏、五倍子、紫草3味药材进行定性鉴别；用高效液相法测定制剂中小檗碱的含量， 采用AichromBond-AQ-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.033 mol/L磷酸二氢钾(用磷酸调节pH值为3.0)-0.025 mol/L十二烷基硫酸钠（48∶30∶25），流速1.0 ml/min，柱温30℃；检测波长345 nm；进样量20μl。用高效液相法对所建立的小檗碱含量测定方法进行方法学验证，证明采用的含量测定方法适合于相应分析要求。验证内容有：线性关系考察，精密度实验，稳定性实验，专属性实验，重复性实验，以及加样回收率实验。结果薄层色谱专属性强；小檗碱的线性范围是0.07～0.28μg，r=0.999 5，平均加样回收率为98.11%，RSD为1.34%（n=6）。结论该方法简便、准确，重现性好，可作为五妙水仙膏质量控制的标准。
【关键词】 五妙水仙膏 小檗碱 五倍子 紫草 黄柏 质量标准
Abstract：ObjectiveTo establish the quality standard for Wumiao Shuixian Cream.MethodsCortex Phellodendri chinense，Radix arnebiae and Galla chinesis in this prescription were identified by TLC.The content of the berberine was determined by HPLC: the column of AichromBondAQC18（4.6 mm×150 mm，5 μm）was used . The mobile phase was CH3CN-0.033 mol/LKH2PO4(trithylamine adjusted pH to 3.0)-0.025 mol/L SDS （48∶30∶25)，at the flow rate of 1.0 ml·min-1，the column temperature was 30℃,and detection wavelength was 345 nm.ResultsThe study on the quality control showed that the characteristic of identification by TLC was distinct and highly specific.The linear range of berberine was in the range of 0.07～0.28μg，r= 0.9995,the average recovery was 98.11%,RSD=1.34%(n=6).ConclusionThe method is simple,accurate and reproducible.It can be used effectively for the quality control of this preparation.
Key words：Wumiao Shuixian Cream ； Berberine; Cortex Phellodendri chinense； Radix arnebiae； Galla chinesis； Quality standard
五妙水仙膏处方来源于原部版标准，具有祛腐生新、清热解毒之效。主治毛囊炎、结节性痒疹、寻常疣、神经性皮炎等。笔者按照中药新药研究规范，根据以上药的理化性质对黄柏，紫草，五倍子进行了鉴别；同时使用HPLC法测定了制剂中小檗碱的含量，建立了可靠、准确、专属性强的质量控制方法。
1 仪器与材料
日本岛津LC-10ADVP高效液相色谱仪，岛津SPD-10AVP紫外检测器，HW色谱工作站。黄柏药材购自淮安市药材公司（由江苏某药业有限公司提供，品种：关黄柏；产地：内蒙），经南京中医药大学王春根教授进行品种鉴定。盐酸小檗碱对照品购自中国药品生物制品检定所（供含量测定用，批号：0713-200107）。3批产品由江苏某药业有限公司生产并提供（批号分别为：050801，050820，050922。甲醇、乙醇等试剂由上海久亿化学试剂有限公司生产，均为分析纯或色谱纯。
2 方法与结果
2.1 定性鉴别
2.1.1 黄柏TLC鉴别［1］
对照品溶液：取盐酸小檗碱对照品，适量加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。
对照药材溶液：取黄柏对照药材1 g，加甲醇5 ml，超声处理15 min，滤过，滤液补充甲醇至5 ml，作为对照药材溶液。
供试品溶液：取本品3 g，加甲醇5ml，用与对照药材溶液相同的方法制得供试品溶液。
阴性对照液：取除黄柏以外的其它4味药材按处方比例制得的阴性样品3 g，用与供试品溶液相同的方法制得阴性对照液。
吸取上述4种溶液各4 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯－醋酸乙酯-异丙醇－甲醇-浓氨试液（18∶9∶7∶9∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的一个黄色荧光斑点；而阴性对照液无此斑点（见图1）。
2.1.2 紫草的TLC鉴别［2］
对照药材溶液的制备：取紫草对照药材0.5 g，加乙醇10 ml，超声处理15 min，滤过，滤液低温浓缩至约1 ml，作为对照药材溶液。
供试品溶液的制备［3］：取本品15 g，加50 ml乙醇，用盐酸调节pH值至6，超声处理20 min，滤过，滤液减压浓缩至无醇味，加石油醚（30～60℃）30 ml振摇提取1次，取石油醚层，加无水硫酸钠3 g，搅匀，静置2 h，滤过，滤液低温浓缩至约1 ml，作为供试品溶液。
阴性液的制备：取除紫草以外的其它4味药材按处方比例制得的阴性样品15 g，用与供试品溶液相同的方法制得阴性对照液。
吸取上述3种溶液各4 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷－丙酮－二氯甲烷-冰醋酸（8∶1∶0.1∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而阴性对照液无此斑点（见图2）。
2.1.3 五倍子TLC鉴别
对照品溶液［4］：取没食子酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液［5］：取本品5 g，加甲醇20 ml，再加水5 ml，用盐酸调节pH值至2，超声处理20 min，滤过，滤液浓缩近干，加甲醇约1 ml，作为供试品溶液。
阴性对照液［6］：取除五倍子以外的其它4味药材按处方比例制得的阴性样品5 g，用与供试品溶液相同的方法制得阴性对照液。
吸取上述3种溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷－甲酸乙酯－甲酸（5∶5∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铁甲醇溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的蓝色斑点，而阴性对照液无此斑点（见图3）。
2.2 含量测定［7］
本方中黄柏中小檗碱是药用的主要成分，且其中含有的小檗碱的化学性质稳定，测定方法简便，故在含量测定时选择制剂中的小檗碱为指标。
2.2.1 色谱条件
AichromBond-AQ-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；柱温：30℃；流动相:乙腈-0.033 mol/L磷酸二氢钾(用磷酸调节pH值为3.0)-0.025 mol/L十二烷基硫酸钠（48∶30∶25），流速1.0 ml/min；检测波长345 nm；进样量20 μl。
2.2.2 对照品溶液的制备
精密称得盐酸小檗碱对照品14.0 mg，置10 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，从中精密吸取1ml置100 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制得每毫升含0.014 mg的对照液，备用。 2.2.3 供试品溶液制备
取本品约5.0 g，精密称定，置具塞三角烧瓶中，精密加入1%盐酸甲醇溶液25 ml，称定重量，超声处理30 min，取出，放冷，再称定重量，用1%盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。
2.2.4 系统适应性考察
分别精密吸取盐酸小檗碱对照液和各供试品溶液20 μl，注入液相色谱仪。理论板数以盐酸小檗碱计，不低于2 000，此时，盐酸小檗碱峰与相邻峰基线分离，分离度R＞1.5，保留时间约为17 min。见图谱4～6。
2.2.5 线性关系考察
分别精密吸取上述盐酸小檗碱对照品溶液2.5，4，5，7.5，10 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀，分别得3.5，5.6，7.0，10.5，14.0 μg /ml的5种对照品溶液。精密吸取各对照液20 μl，注入液相色谱仪，各进2针。以进样量C（μg）对平均峰面积A进行回归处理，得回归方程，C=1.0×10-6A+0.028 8，r=0.999 5，线性范围是0.07～0.28 μg。
2.2.6 精密度实验
精密吸取浓度为14.0 μg /ml对照品溶液20 μl，连续进样5次，测得盐酸小檗碱峰面积积分值, RSD为0.2%。
2.2.7 稳定性实验
精密吸取批号为050801的第1个供试液20 μl，每间隔3 h进一针，连续考察12 h，结果盐酸小檗碱峰面积值的RSD为1.62%，表明在12 h内基本稳定。
2.2.8 专属性实验在与样品测定
完全相同的条件下,精密吸取20μl阴性对照液，连续进3针。阴性无干扰，说明在五妙水仙膏中，盐酸小檗碱的专属性较强。
2.2.9 重复性实验
取批号为050801样品5.0 g，共6份，精密称定。按样品测定项下的方法测定，测得样品中指标成分盐酸小檗碱的含量，RSD=1.85%，结果表明重复性良好。
2.2.10 加样回收率实验
供试品溶液：取批号为050801的样品5.0 g，共6份，精密称定，分别置具塞三角烧瓶中，各精密加入浓度为14.0 μg /ml的盐酸小檗碱对照液14.5 ml，用与“2.2.3”项相同的方法制得供试液。对照品溶液：精密称得盐酸小檗碱对照品13.7 mg，置10 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，从中精密吸取1 ml置100 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制得每毫升含0.013 7 mg的对照液。精密吸取上述对照液及各供试液20 μl，分别进2针。采用随行标准，用外标一点法定量，测得盐酸小檗碱的含量。结果见表1。表1 加样回收率实验结果（略）
2.2.11 样品测定
精密吸取浓度为0.013 8 mg/ml的对照液及各供试液20 μl，分别进2针。采用随行标准，用外标一点法定量。根据取样量和稀释度，计算含量。结果见表2。表2 样品含量测定结果（略）
由实验结果可知，仪器的精密度、指标成分的稳定性、方法的重现性和加样回收率等均较好，符合定量要求。根据以上测定结果，暂定每克五妙水仙膏中含黄柏以盐酸小檗碱（C20H17NO4·HCl）计，不得少于0.03 mg。
3 结论
黄柏的薄层鉴别，用文献展开剂：苯-醋酸乙酯-异丙醇-甲醇-浓氨溶液 （6∶3∶1.5∶1.5∶0.5），但所得斑点Rf值太小。调节展开剂各成分的配比，用甲苯-醋酸乙酯-异丙醇-甲醇-浓氨溶液（18∶9∶7∶9∶2）展开结果Rf值适中，斑点适中；紫草中的主要成分为紫草素，五倍子中的主要成分为没食子酸，两者均为酸性成分。而该药品中因含有生石灰、碳酸钠而显碱性。因此，在对供试品溶液的处理时，需用盐酸调pH值至酸性，使紫草素、没食子酸呈游离状态，再用合适的溶剂提取。
用高效液相法测定药品中小檗碱含量时，文献中的流动相为乙腈-0.033 mol/L磷酸二氢钾(用磷酸调节pH值为3.0)-0.025 mol/L十二烷基硫酸钠（45∶30∶25）,但实验发现出峰时间较长，分离效果不佳；当改用乙腈-0.033 mol/L磷酸二氢钾(用磷酸调节pH值为3.0)-0.025 mol/L十二烷基硫酸钠（48∶30∶25）时，出峰时间适中，分离效果很好。
【参考文献】
［1］国家药典委员会.中国药典［S］.北京：化学工业出版社，2005：45,214,238.
［2］刘训红.中药材薄层色谱鉴别［M］.天津：天津科学技术出版社，1990:68，105，132.
［3］魏璐雪.中药药物分析［M］.上海：上海科学技术出版社，2002：109.
［4］陈德昌.中药化学对照品工作手册［M］.北京：中国医药科技出版社，2000：87,121,276.
［5］王玉珍，陈再兴，孟宪生，等．瘢痕涂膜质量标准的研究［J］.中草药，1999，30（6）：431.
［6］王景涛，王景刚，李可强．妇宁康片的薄层鉴别研究［J］.辽宁中医药大学学报，2007，9（1）：140.
［7］夏金华．复方紫草油搽剂质量控制方法［J］.海峡药学，2005，17（4）：78. |
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发表于 2014-8-1 22:53:02
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