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大蒜辣素致肝癌细胞HepG2凋亡研究【摘要】 目的研究大蒜辣素（Allicin）导致肝癌细胞HepG2凋亡的现象及其影响规律。方法运用CCK－8试剂盒研究Allicin对HepG2细胞增殖的影响，运用流式细胞仪检测其对细胞凋亡、DNA代谢的影响，运用免疫印迹（Western blot）研究肝癌细胞凋亡基因表达的影响。结果Allicin能抑制HepG2细胞的增殖，细胞倍增时间延长为4 d，同时Allicin也能导致细胞出现大量凋亡，实验结果表明其凋亡率最高为4.13％，死亡率达到70.38%。细胞周期实验结果表明Allicin能使大部分细胞处于DNA合成期的S期及G0/G1期，延缓细胞增殖。Western blot实验结果表明Allicin能激活细胞凋亡基因提高药物的治疗效果。结论Allicin能抑制肝癌细胞的增殖可导致细胞大量死亡并引起细胞凋亡，并能引起细胞DNA代谢发生紊乱，细胞大部分被阻滞在DNA合成的G0/G1期，细胞分裂被抑制，Western blot实验结果表明细胞凋亡基因大量表达，细胞发生凋亡。
【关键词】 大蒜辣素； 生长曲线； 凋亡； DNA周期； HepG2肝癌细胞； Western blot； 免疫印迹
Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of apoptosis on heptoma cell lines HepG2 caused by allicin. MethodsCCK-8 was exerted to investigate the proliferation of the HepG2 cell and cytometry machine was used to detect the apoptosis and mortality rate, finally western blot method was used to study the apoptosis protein expression. ResultsExperimental results showed that allicin could inhibit the proliferation of cells and cause the cell apoptosis and death, and the highest ratio of apoptosis and death were 4.13% and 70.38%, respectively. Cell cycle experimental results indicated that the DNA metabolism was disturbance and most of them were blocked in G0/G1 period resulting in cells mitosis were blocked too. Western blot results showed that allicin the actived apoptosis gene of cells.ConclusionAllicin can inhibit the HepG2 cell proliferation and cause cell death and apoptosis, furthermore Allicin can cause cell DNA metabolism disturbance.Western blot experiments results show that the apoptosis gene can increase expression.
Key words： Allicin; Proliferation curve; Apoptosis; Cell cycle; Western blot; HepG2
大蒜辣素(Allicin)是新鲜大蒜(garlic)有效成分提取物，分子式为C6H10OS2［1～3］。研究表明，Allicin可以降低血清胆固醇和甘油三酯水平，减少动脉粥样硬化的形成以及血小板的凝集，同时还具有抑制微生物的作用，可以抑制癌细胞增殖及诱导癌细胞的凋亡，并表现出了肿瘤杀灭作用。已有Allicin对癌细胞生物效应的研究主要集中在胃癌及肠癌等的研究［4］，对肝癌的研究甚少。本文即研究Allicin对人肝癌细胞HepG2的增殖及凋亡的影响，通过探讨细胞DNA代谢紊乱及凋亡基因表达进行分子学水平的机理探讨。
1 材料及试剂
UV2550型紫外分光光度计，Waters 2996高效液相色谱仪，Empower数据处理软件，细胞培养箱为美国Thermo公司产品，流式细胞仪购自美国BD公司。HepG2人肝癌细胞购自中国科学院上海细胞库，胰蛋白酶、高糖DMEM培养基、胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)购自Gibco公司，二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide, DMSO)购自美国Sigma公司，青霉素、链霉素为杭州四季青公司产品，大蒜辣素由江苏省药品检验所提供。CCK-8试剂盒为日本同仁化学研究所产品，试剂盒编号WN717，细胞凋亡及周期试剂试剂盒均为流式细胞仪用购自美国BD公司，Western blot试剂盒购自英国abCam公司。
2 方法
2.1 细胞培养HepG2细胞培养培养条件为含10％FBS高糖DMEM培养基，细胞种植到细胞培养瓶后放置在5％CO2培养箱持续培养。细胞传代时用胰蛋白酶消化细胞成细胞悬液，用磷酸盐缓冲液(PBS)在1 500 r/min离心转速下离心洗涤两次，用含10％FBS DMEM培养基重悬细胞后种植细胞，每次细胞种植浓度应大于105 cells/ml。细胞临时保存在-70℃超低温冰箱，永久保存在液氮罐中，细胞冻存液配比为DMEM∶FBS∶DMSO=7∶2∶1(体积比)，细胞冻存时其浓度应高于106 cells/ml。
2.2 大蒜辣素溶液的制备通过色谱条件优化，建立了高效液相制备色谱的色谱条件：C18色谱柱（18 mm × 250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（70:30），检测波长240 nm，全自动组分收集器收集相应的组分，得高纯度的大蒜辣素溶液（纯度大于99.0%）。大蒜辣素含量测定方法按《欧洲药典》5.0收载的“garlic powder”中采用对照品替代的方法进行测定［5，6］。
2.3 大蒜辣素孵育细胞将不同浓度新鲜制备得到的大蒜辣素同时加入到6个细胞初始种植浓度相同的细胞培养瓶中，大蒜辣素浓度分别为0，20，40，80，120，160 μg/ml，孵育时间为24 h，孵育完成后进行检测。
2.4 细胞增殖实验运用CCK-8试剂盒检测细胞增殖速率，最后结果绘成生长曲线。实验方法按试剂盒提供实验方法进行［7］。首先制备细胞悬液，依照次序对应分别加入96孔板中;接种细胞数量为1 000 cells/孔，培养基体积100 μl/孔，37℃孵箱中培养2～4 h，加入不同浓度的大蒜辣素，分别标记样品编号，继续放入37℃孵箱中培养2 h，加入10 μl CCK-8于样品孔中，37℃孵箱中培养2 h后，每孔加10 μl 0.1mol/L HCl终止显色反应。吸光度测试所用入射光波长为450 nm。每隔12 h重复进行以上步骤，72 h得到细胞增殖数据绘制细胞增殖曲线。
2.5 细胞凋亡及周期检测细胞凋亡及周期实验均在流式细胞仪上完成。凋亡实验按试剂盒所示方法进行，首先将Allicin孵育后细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液，并用PBS洗涤两次并将细胞浓度重悬浓度调整为106 cells/ml。染色过程为首先用微量移液枪移取20 μl细胞悬液，然后用Annexin-V加入到细胞悬液中并避光静置15 min后将PI染料加入并静置30 min，准备上机实验。流式细胞仪机上实验条件为：细胞进样流速中速，前向角补偿电势为56 V。细胞周期实验方法按试剂盒所述方法进行，首先按凋亡实验相同方法处理细胞以待上机检测，染色方法为将试剂盒内A、B、C、D 4种试剂按顺序分别加入到细胞悬液中，避光静置时间均为15min。染色完成后上机实验。
2.6 免疫印迹（Western blot）实验肝癌细胞的暂时保存及洗涤都在磷酸盐缓冲液（PBS）中完成。收集细胞，PBS洗涤细胞两次，加细胞裂解液，超声破碎细胞。用抗凋亡抗体在40℃孵育肝细胞溶胞产物1 h，孵育在含牛血清白蛋白（BSA）、吐温（Tween）浓度均为0.1%的PBS中进行。用SDS-PAGE提取凋亡蛋白，并通过电转移使之转录到聚偏二氟乙烯（PVDF）撑体中［8，9］。运用ECL Western blot 检验系统检测免疫复合物。
2.7 统计学处理实验结果用±s表示，使用SPSS10.0软件自动进行统计分析，实验数据采用t检验，多组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 细胞增殖实验结果见图1。
图1 不同浓度Allicn孵育HepG2细胞增殖曲线图（略）
实验结果表明随着Allicin加入量的提高细胞增殖抑制率增加，当Allicin加入浓度达到120 μg/ml时细胞倍增时间延长为4 d，对照组(未经Allicin处理组)倍增时间为2 d，并且在其生长曲线中细胞未出现明显的指数增长期即曲线斜率未出现明显的改变而出现一个平台，对照组则出现指数增长并且当培养超过2 d后细胞增殖进入平缓期。实验结果表明Allicin能很好的抑制肝癌细胞的增殖扩散，其影响规律为当加入浓度未超过120 μg/ml时细胞增殖抑制与之呈正相关性随着加入浓度的提高其 抑制率可达到70%，加入浓度超过120 μg/ml后抑制效果未增强与120 μg/ml时比较未出现明显增强。
3.2 细胞凋亡死亡及细胞周期实验结果细胞凋亡实验结果见图2及表1；周期检测实验结果见图3及表2。由于Allicin的加入导致癌细胞发生凋亡，在低Allicin加入浓度时细胞的凋亡率随其加入浓度的提高而增加，但浓度达到120 μg/ml时细胞凋亡率达到最大值4.13%，超过此浓度后与120 μg/ml浓度结果相比较未发生明显的变化。同时实验结果表明Allicin也能导致细胞大量死亡，其最高死亡率达到70.31%，其变化规律与凋亡变化规律类似。3.3 Western-blot实验结果见图4。图4表明处理过后细胞凋亡基因-bcl家族基因大量表达，根据所在条带灰度可得当Allicin浓度达到120μg/ml时其相关蛋白表达达到72.0 kD，其它浓度的相关蛋白表达分别为0，12，25，75，150 kD，由此可以得出随着Allicin加入量的提高细胞凋亡基因的表达量也提高，并且当Allicin浓度超过120 μg/ml后单纯提高药物剂量并不能提高此蛋白的表达量以提高细胞的凋亡率。
图2 不同浓度Allicin孵育HepG2细胞早期凋亡及死亡图（略）
表1 不同浓度Allicin孵育HepG2细胞早期凋亡及死亡数据表（略）
每组数据均为三组平行实验数据平均值，数据统计采用t检验，P<0.05
表2 不同浓度Allicin孵育HepG2细胞周期数据表（略）
每组数据均为三组平行实验数据平均值，数据统计采用t检验，P<0.05
4 讨论
Allicin是大蒜有效成分提取物，目前《欧洲药典》等将其当作大蒜有效成分标准物质［10,11］。目前已有研究表明Allicin能有效抑制消化道癌症的发生、生长及扩散［12～15］，也能有效抑制肺癌的发生及发展。本文即以Allicin对体外培养肝癌细胞HepG2的抑制作用进行研究。
肝癌细胞增殖实验表明Allicin能抑制体外培养细胞的增殖，当浓度<120 μg/ml Allicin对细胞增殖抑制作用随着浓度的提高而增加，当浓度超过此标准时，继续加大Allicin的加入浓度对细胞的影响与此浓度时的效果相似。
图3 不同浓度Allicin孵育HepG2细胞周期实验结果图（略）
图4 不同浓度Allicin孵育HepG2细胞Western blot实验结果（略）
凋亡及死亡实验结果表明，随着Allicin加入浓度的提高，细胞凋亡及死亡率均提高，当加入浓度达到120 μg/ml后细胞凋亡率达到最高为4.13%和70.38%，细胞增殖被抑制，当加入浓度超过此浓度后凋亡与死亡率不再发生明显变化。实验结果表明Allicin对肝癌细胞最佳影响浓度范围为80～120μg/ml，与细胞增殖试验结果类似，在此条件下细胞增殖被抑制。
细胞DNA周期实验结果表明，由于Allicin的加入能导致细胞DNA代谢发生紊乱，细胞被阻滞在细胞DNA合成的G0/G1期即二倍体期，大部分细胞未进入有丝分裂的四倍体期，进而导致细胞增殖分裂被抑制。增殖被抑制后，细胞将会发生死亡或凋亡，细胞死亡与凋亡实验结果也验证此推论，由于Allicin的加入导致细胞发生大量的死亡和凋亡。
Western blot实验结果表明由于Allicin的加入导致细胞的凋亡基因大量表达由此也引起细胞发生凋亡。细胞周期及Western blot实验结果同时表明Allicin能进入到细胞内影响细胞的DNA代谢及基因表达从而达到治疗肝癌疾病的目的。
本文探讨了Allicin对体外培养肝癌细胞的增殖抑制并对其影响机理进行分子程度的研究得到Allicin能有效的抑制肝癌细胞的增殖导致细胞发生大量的死亡及凋亡并能引起细胞DNA代谢紊乱，Western blot实验结果表明由于Allicin的作用能激活细胞凋亡基因使之大量表达。以上研究表明Allicin能很好地抑制肝癌细胞的增殖从而达到抑制肝癌细胞大量扩散的趋势避免肝癌细胞对正常肝脏细胞的吞噬从而达到治疗肝癌的目的，为肝癌疾病的治疗提供一种新的具有较好疗效且毒副作用小的药物。
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发表于 2014-8-1 10:50:49
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