凤尾蕨属6种药用植物抗肿瘤有效部位筛选

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作者：龚先玲，苟占平，梁念慈，刘义，李立

【摘要】  目的对凤尾蕨属6种药用植物抗肿瘤有效部位进行筛选。方法采用MTT法对凤尾蕨属6种药用植物不同溶剂萃取物进行体外抗肿瘤活性测试。结果半边旗的醋酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物;刺齿半边旗的石油醚萃取物、醋酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物;井栏边草的醋酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物;剑叶凤尾蕨的醋酸乙酯萃取物;线羽凤尾蕨的正丁醇萃取物对人肺癌细胞A549增殖均有明显的抑制作用。结论上述凤尾蕨属几种药用植物的萃取物具有较好的体外抗肿瘤活性，是其抗肿瘤作用的有效部位。

【关键词】  凤尾蕨属; 抗肿瘤作用; 有效部位

　　Abstract：ObjectiveTo screen the active fraction with antitumor effect from 6 medicinal plants of Pteris L..MethodsThe samples of the 6 plants were extracted with ethanol at first, and then the ethanol extracts were separated with petroleum ether, ethyl acetate, n-Butyl alcohol in turn to get three fractions. Then the antitumor effect of the extracts were tested with MTT method.ResultsEthyl acetate and n-BuOH extracts of Pteris semipinnta L., petroleum ether, ethyl acetate and n-BuOH extracts of P. dispar Kze., ethyl acetate and n-BuOH extracts of P. multifida Poir., ethyl acetate extract of P. ensiformis Burm.,and n-BuOH extract of P. linearis L. were shown to have significant inhibitory effect against human lung cancer cell A549.ConclusionThe extracts of the plants from Pteris are proved to be the antitumor active fractions in vitro.

　　Key words：Pteris; Antitumor effect; Active fraction

　　半边旗药材为来源于凤尾蕨属植物半边旗Pteris semipinnta L.的干燥全草[1]。从中分离到的二萜类化合物5F、6F和A具有抗肿瘤作用[2,3]，其中5F含量较高，但活性不是很强，6F和A活性很强，但其在原植物中的含量太低而不能开发利用。2006年由我们申报，半边旗药材被广东省食品药品监督管理局批准为广东省地方药材标准品种。根据药用植物亲缘学的原理，亲缘关系相近的植物其所含化学成分相似，而化学结构相似的化合物其生理活性多相似[4]，因此，我们在研究半边旗抗肿瘤作用的基础上，对与半边旗同属的其他5种药用植物的抗肿瘤药效部位进行了筛选，以期发现抗肿瘤活性强的含量较高的二萜类化合物。

　　1 仪器与材料

　　1.1 仪器旋转蒸发仪，AE-240天平;NAPCO series 5400 CO2培养箱，Elx 酶标仪(Bio-TEK- INSTUMENTS INC产品);96孔培养板(美国Costar)。

　　1.2 材料乙醇、醋酸乙酯、正丁醇(分析纯);小牛血清(杭州四季青生物材料有限公司);RPMI 1640培养基(GIBCO);二甲基亚砜(DMSO)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、胰蛋白酶、甲基噻唑蓝(MTT)(美国Sigma公司)。半边旗Pteris semipinnta L.采于广州市郊，刺齿半边旗P. dispar Kze.、井栏边草P. multifida Poir.、剑叶凤尾蕨P. ensiformis Burm.、蜈蚣草P. vittata L.采于广东湛江，线羽凤尾蕨P. linearis L.采于广东东莞，由广东医学院生药学副教授苟占平博士鉴定。人肺癌A549细胞株，由本实验室传代培养。

　　2 方法

　　2.1 实验药品的制备将采集的6种新鲜样品半边旗、刺齿半边旗、井栏边草、剑叶凤尾蕨、蜈蚣草、线羽凤尾蕨放于阴凉处晾干，粉碎。取上述6种粉碎的样品各50 g，加乙醇500 ml，水浴回流提取2次，3 h/次，合并滤液，滤液减压浓缩至干，浸膏加水溶解，依次用石油醚(60～90℃)、醋酸乙酯、正丁醇萃取，将萃取物减压浓缩至干，得到上述6种样品的石油醚、醋酸乙酯、正丁醇干膏。以上18种干膏先用DMSO溶解，再加PBS溶解，精确配制成2400 μg·ml-1的储存液(DMSO的体积分数=1%)，过滤除菌，放4℃冰箱备用。

　　2.2 细胞培养人肺癌A549细胞培养于含10%小牛血清、100 kU·L-1 青霉素、100 mg·L-1 链霉素的RPMI-1640培养液中，在37℃、5% CO2 培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于实验。

　　2.3 细胞增殖抑制试验(MTT法) 取对数生长期的人肺癌细胞A549，用0.25%的胰蛋白酶消化，10% 新生小牛血清的RPMI-1640培养液调制成5×104个·ml-1的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔接种100 μl。在37℃、5%、CO2条件下培养过夜后，吸出培养液，加入新培养液180μl及药液20 μl。待测样品中DMSO终体积分数=0.1%，干膏样品的终浓度分别为30，60，120，240 μg·ml-1，每个浓度平行6孔;培养72 h后，每孔加入5 mg·ml-1的MTT 20 μl，37℃， 5% CO2条件下温育4～ 6 h，弃去上清液，每孔加入150 μl DMSO，在微型振荡器上摇匀15 min，结晶溶解后，立即比色，在酶标仪主波长为570 nm，参比波长为630 nm处测量OD值，比色以空白孔调零。抑制率(%)=(1-实验组6孔OD值平均值/对照组6孔OD值平均值)×100%。

　　2.4 统计分析采用SPSS11.0。

　　3 结果

　　3.1 凤尾蕨属同一植物不同提取部位对A549肿瘤细胞生长增殖的影响

　　3.1.1 半边旗各提取部位对体外培养的A549肿瘤细胞生长增殖的影响 半边旗各提取部位的体外抗肿瘤活性显示(表1)，其石油醚提取物、醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物在各个质量浓度范围对肿瘤细胞均有抑制作用;石油醚提取物对A549肿瘤细胞的增殖抑制有一定的剂量依赖性;而醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物对A549肿瘤细胞的增殖抑制呈明显的剂量依赖性，在240 μg·ml-1时抑制作用非常明显，抑制率分别为88.55%，61.72%。

　　表1 半边旗各提取部位对体外培养的A549肿瘤细胞生长增殖的影响

　　3.1.2 刺齿半边旗各提取部位对体外培养的A549肿瘤细胞生长增殖的影响刺齿半边旗各提取部位的体外抗肿瘤活性显示(表2)，石油醚提取物、醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物在各个质量浓度范围对A549肿瘤细胞都有较强的抑制作用，在240 μg·ml-1时的抑制率分别为57.87%，77.15%，84.61%;且有明显的剂量依赖性。　3.1.3 井栏边草各提取部位对体外培养的A549肿瘤细胞生长增殖的影响井栏边草各提取部位的体外抗肿瘤活性显示(表3)，石油醚提取物、醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物在各个质量浓度范围对肿瘤细胞均有抑制作用;醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物在浓度为240 μg·ml-1时，对A549肿瘤细胞有明显的抑制作用，抑制率分别为65.06%和82.13%。

　　表2 刺齿半边旗各提取部位对体外培养的A549肿瘤细胞生长增殖的影响

　　表3 井栏边草各提取部位对体外培养的A549肿瘤细胞生长增殖的影响

　　3.1.4 剑叶凤尾蕨各提取部位对体外培养的A549肿瘤细胞生长增殖的影响剑叶凤尾蕨各提取部位的体外抗肿瘤活性显示(表4)，240 μg·ml-1的醋酸乙酯提取物对A549肿瘤细胞有较强的抑制作用，而此浓度的正丁醇提取物对A549肿瘤细胞的抑制率为15.25%，该浓度的石油醚提取物对A549肿瘤细胞的抑制作用仅为8.74%。

　　表4 剑叶凤尾蕨各提取部位对体外培养的A549肿瘤细胞生长增殖的影响

　　3.1.5 蜈蚣草各提取部位对体外培养的A549肿瘤细胞生长增殖的影响蜈蚣草各提取部位的体外抗肿瘤活性显示(表5)，各提取部位对A549肿瘤细胞的抑制作用都较弱，石油醚提取物、醋酸乙酯提取物和正丁醇提取物在240 μg·ml-1时，对A549肿瘤细胞的抑制率分别为24.60%，22.76%，14.29%。

　　表5 蜈蚣草各提取部位对体外培养的A549肿瘤细胞生长增殖的影响

　　3.1.6 线羽凤尾蕨各提取部位对体外培养的A549肿瘤细胞生长增殖的影响 线羽凤尾蕨各提取部位的体外抗肿瘤活性显示(表6)，其正丁醇萃取物对A549肿瘤细胞有较强的抑制作用，且呈一定的剂量依赖性;醋酸乙酯提取物对A549肿瘤细胞的抑制作用较弱，而石油醚提取物对A549肿瘤细胞的增殖在低浓度时有一定的促进作用，在240 μg·ml-1时的抑制率仅为2.49%。

　　表6 线羽凤尾蕨各提取部位对体外培养的A549肿瘤细胞生长增殖的影响

　　3.2 凤尾蕨属6种植物同一提取部位对A549细胞增殖影响的比较见图1～3。

　　图1 凤尾蕨属6种植物石油醚萃取部位对A549细胞增殖的影响

　　从图1可以看出，当药物浓度为240μg·ml-1时刺齿半边旗石油醚萃取物对A549细胞的增殖抑制作用最强，超过55%，依次为蜈蚣草石油醚萃取物(抑制率近25%)，半边旗石油醚萃取物(抑制率15%左右)，其余3种植物的该部位萃取物A549细胞的抑制作用更低，几乎都在10%以下。

　　从图2可以看出，当药物浓度为240μg·ml-1时，半边旗醋酸乙酯萃取物对A549细胞的增殖抑制作用最强，其次为刺齿半边旗醋酸乙酯萃取物，井栏边草醋酸乙酯萃取物，剑叶凤尾蕨醋酸乙酯萃取物，蜈蚣草醋酸乙酯萃取物，线羽凤尾蕨醋酸乙酯萃取物，最后两种的醋酸乙酯萃取部位对A549细胞的抑制作用较低，在20%左右，其余几种的该部位对A549细胞的抑制率均高于50%。

　　图2 凤尾蕨属6种植物醋酸乙酯萃取部位对A549细胞增殖的影响

　　图3 凤尾蕨属6种植物正丁醇萃取部位对A549细胞增殖的影响

　　从图3可以看出，当药物浓度为240μg·ml-1时刺齿半边旗正丁醇萃取物对A549细胞的增殖抑制作用最强，其次为井栏边草正丁醇萃取物，线羽凤尾蕨正丁醇萃取物和半边旗正丁醇萃取物，它们对A549细胞的抑制率均高于60%，而剑叶凤尾蕨正丁醇萃取物和蜈蚣草正丁醇萃取物在该浓度时对A549细胞的抑制率均在15%左右。

　　4 讨论

　　半边旗具有较强的抗肿瘤作用，本实验在研究半边旗抗肿瘤作用的基础上，以人肺癌细胞A549为筛选模型，以抗肿瘤活性为指标，较系统地对凤尾蕨属6种药用植物不同提取部位进行了抗肿瘤活性的初步筛选。结果表明，半边旗中抗肿瘤作用的物质存在于醋酸乙酯部位、正丁醇部位，这与我们前面的筛选研究结果一致[5];刺齿半边旗的抗肿瘤作用部位存在于石油醚部位、醋酸乙酯部位、正丁醇部位;井栏边草中抗肿瘤作用的物质存在于醋酸乙酯部位、正丁醇部位;剑叶凤尾蕨中抗肿瘤作用的物质存在于醋酸乙酯部位;线羽凤尾蕨中抗肿瘤作用的物质存在于正丁醇部位;其他部位对A549细胞增殖抑制作用不明显。值得注意的是，刺齿半边旗石油醚萃取物在浓度为240μg·ml-1时其抑制率接近60%，而半边旗石油醚萃取物在相应浓度时其抑制率仅为15.12%;刺齿半边旗醋酸乙酯萃取物在浓度为60μg·ml-1时其抑制率已超过50%，在浓度为120μg·ml-1时其抑制率已接近70%，而半边旗醋酸乙酯萃取物在相应浓度时其抑制率仅分别为19.92%和35.67%;刺齿半边旗正丁醇萃取物在浓度为60μg·ml-1时其抑制率已超过70%，井栏边草正丁醇萃取物在浓度为120μg·ml-1时其抑制率已超过75%，而半边旗正丁醇萃取物在相应浓度时其抑制率仅分别为5.13%和27.83%。

　　本课题组虽然对半边旗中的抗肿瘤二萜类活性成分5F进行了深入的研究，但对其所含抗肿瘤活性比5F更强的6F和A却由于含量低的原因未能进一步开发研究。本实验的目的是确定与半边旗同属的其他植物的抗肿瘤活性部位，为下一步在活性作用的指导下，进一步发现抗肿瘤作用比5F更强的含量较高的二萜类化合物提供研究基础。

【参考文献】
  　[1] 王玉生，蔡乐文. 南方药用植物图鉴[M]. 汕头：汕头大学出版社，2005：18.

　　[2] 张 晓，李金华，何承伟，等.半边旗中二萜类化合物的植化及抗肿瘤活性初步研究[J].中国药学杂志，1999，34(8)：512.

　　[3] 戴 滨，崔 燎，吴 铁，等. 半边旗提取物5F抗肿瘤作用的实验研究[J].四川中医，2006，24(2)：10.

　　[4] 彭四保，彭 勇，陈士林，等.药用植物亲缘学[J].世界科学技术-中医药现代化，2005，7(6)：97.

　　[5] 龚先玲，陈志红，梁念慈.半边旗提取物及化学成分抗肿瘤作用的研究[J].四川中医，2008，27(7)：51.