人细小病毒B19中国株VP1蛋白独特区基因片段序列变异分

JZ041567

  作者：采华 张国成 许东亮 李飚


【关键词】  克隆
    关键词: 细小病毒B19，人;克隆，分子;序列分析  
    摘 要:目的  研究B19病毒中国株独特区VP1的基因变异. 方法  采用聚合酶链反应技术（PCR）从两例中国再生障碍性贫血患儿血清中扩增VP1独特区基因片段，将其与PUC19连接，酶切鉴定筛选阳性克隆后测序分析. 结果  从一个患儿的血清中扩增出约480bp目的片段，并成功构建PUC19-VP1质粒，测序结果显示，与国外已发表的Wi株VP1独特区序列相比，有2处核苷酸发生改变，并可致所编码的氨基酸变化. 结论  中国B19病毒VP1独特区有变异.

      
　　Keywords:parvovirus B19，human;cloning molecular;se-quence analysis
      
　　Abstract:AIM To obtain and sequence DNA clone of VP1unique region of human parvovirus B19from Chinese patients and to further study the genetic mutation of human par-vovirus B19of the Chinese strain.METHODS Two samples of VP1unique region of HPVB19were amplified from aplas-tic crisis serum of two Chinese children by PCR.The target fragment was linked with PUC19.Positive clones were cho-sen by identification of endonuclease cut and sequenced.RE┐SULTS A target fragment of480bp was amplified by PCR from the serum samples of one patient.Compared with the published B19VP1unique sequences，two base-pair and de-duced amino acid were found changed.CONCLUSION There are two mutations in the nucleotide sequence encoding the unique region of VP1of human parvovirus B19of the Chinese strain.
      
　　0 引言
      
　　许多研究表明，人细小病毒B19（HPVB19）与人类多种疾病密切相关［1-4］ ，可致孕妇流产、死胎及儿童传染性红斑、一过性再生障碍性贫血危象（TAC）、急性血小板减少性紫癜等疾病.近年有报道各国的流行株有变异［5-7］ ，我国尚缺乏此方面的研究.为了揭示我国B19病毒流行株的核苷酸序列及变异特点，我们克隆和分析了VP1独特区基因，以便为制备诊断试剂及基因工程疫苗奠定基础.
      
　　1 材料和方法
      
　　1.1 材料  搜集1999-12我院儿科再生障碍性贫血患儿血清标本2份，-20℃冰箱保存备用待检.根据HPVB19DNA全序列［8］ ，自行设计VP1独特区引物一对，上游引物位于2444-2466位碱基，并在5’末端引入BamHI酶切位点，序列为AAGGATCCAT-GAG TAAAGAAAGTGGCAAATG;下游引物位于2901-2923位碱基，并在5’末端引入SalI酶切位点，序列为AGTCGACTCACAGTTGGCTATACCTA-AAGTCAT，该引物扩增的靶序列为480bp，引物由上海生工生物工程公司合成.HPVB19阳性对照模板质粒由沙特皇家医院研究中心（KFSH Research Center）提供，经提纯后含量为70μg・L-1 .Taq DNA聚合酶、PCR相对分子质量标记、SalⅠ，BamHⅠ，T4DNA连接酶、琼脂糖DNA回收试剂盒等均购自华美生物工程公司.  
　　1.2 方法
      
　　1.2.1 血清标本DNA的提取  按已报告的方法［9］ ，提取DNA为PCR反应的模板.
      
　　1.2.2 PCR反应  50μL反应体系中，双蒸水31μL，10×PCR buffer5μL，4×dNTP4μL，25mmol・L-1 MgCl2 3μL，上游引物和下游引物各1μL（20pmol），DNA模板5μL（阳性对照1μL，阴性对照以双蒸水为模板），Taq酶33.34nkat，93℃1min，55℃90s，72℃1min，35个周期循环后，72℃充分延伸10min，20g・L-1 琼脂糖凝胶电泳、EB染色并回收PCR产物.
      
　　1.2.3 重组质粒的构建  BamHI，SalI酶切回收的PCR产物及PUC19载体，经37℃水浴5h，回收酶切完全的PCR产物和PUC19，16℃加T4DNA连接酶连接过夜，65℃5min失活连接酶.应用氯化钙制备新鲜感受态细胞，将PCR产物与PUC19的连接反应液转化100μL大肠杆菌XL1Blue感受态细胞，经培养，在含X-gal和IPTG的LB平板上筛选白色菌落，培养增菌后提取质粒，并以BamHI和SalI酶切确定其正确性.
      
　　1.2.4 DNA序列测定  在上海基康公司用ABI3700自动测序仪测序.
      
　　2 结果
      
　　2.1 PCR扩增HPVB19VP1独特区片段  用所设计引物结果扩增出HPVB19VP1片段，在相当于位置480bp显示其核苷酸片段大小与预期值一致（Fig1），阴性对照未扩增出特异片段.
      
　　2.2VP1┐PUC19重组质粒的构建  将上述阳性扩增产物HPVB19VP1基因与克隆载体PUC19连接，获得重组质粒HPVB19VP1-PUC19，再将重组质粒用BamHI和SalI双酶切，得到一条480bp片段，证明目的片段已正确插入PUC19载体（Fig2）.
           
　　图1 － 图2 略
      
　　2.3 HPVB19VP1独特区克隆测序  如Fig3所示，与B19Wi株［10］ 的VP1独特区序列相比，有2处碱基不同:第2594位由C变为A，相应的氨基酸由组氨酸变为天冬酰氨;第2624位由A变为G，相应的氨基酸由天冬酰氨变为天冬氨酸.重复3个克隆，测序结果同前.
　图3 略
      
　　3 讨论
      
　　人细小病毒B19是由5.6kb核苷酸组成的单链线状DNA分子，编码一个非结构蛋白（NS1）和两个结构蛋白（VP1、VP2）［11］ .B19壳蛋白主要由VP2蛋白组成，VP1蛋白不超过壳蛋白的10%，其独特区暴露在病毒的表面［12，13］ .我国人群有较高的B19病毒感染率，但流行的病毒中国株基因是否有变异，国内尚无报告.B19病毒的抗原表位区集中在VP1独特区和VP1-VP2连接区.只有HPVB19VP1独特区和VP1-VP2连接区基因编码的蛋白，才能刺激机体产生保护性抗体［14，15］ .因此对VP1独特区基因克隆，研究其基因的变异，在制备诊断试剂及基因工程疫苗等方面有很大的实际意义.
    为了对中国人感染的HPVB19VP1独特区基因序列进行分析，本实验从再生障碍性贫血患儿血清标本中扩增出HPVB19VP1独特区基因片段，并对其进行克隆测序.结果与国外报道的B19病毒Wi株基因序列相比较，有2处碱基不同，重复3个克隆，发现位于第2594、2624位密码子的改变稳定，分别为C→A、A→G，说明这些碱基的变化不是由于PCR过程中碱基错配引起，而是因为原始模板的不同.理论上此2处核苷酸位点的变化，会导致所编码氨基酸的改变，从而影响到VP1蛋白免疫原表位，故需要进一步研究我国B19病毒流行株VP1基因变异的特征，及其引起的VP1蛋白结构和功能的变化，为研制我国的诊断B19病毒感染的试剂和预防疫苗积累更多的资料.本文在国内较早报道B19病毒流行株的VP1基因变异.关于VP1和VP2连接区及NS1基因的变异，目前我们正在研究.HPVB19中国株VP1独特区基因的获得为进一步研究其基因变异提供了方法和资料.  
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