中药对衰老大鼠肝细胞超微结构的影响

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【摘要】  目的研究制首乌、北沙参、紫丹参三味中药的保肝抗衰老作用。方法用D-半乳糖皮下注射，将2月龄大鼠制成衰老模型，用药组在造模的同时给予制首乌、北沙参、紫丹参3味药灌胃，40 d后用电子显微镜观察各组大鼠肝细胞的形态学变化。结果衰老模型组肝细胞体积缩小，细胞核和细胞器损伤严重；中药治疗组肝细胞体积正常，细胞核和细胞器保持良好，接近正常对照组肝细胞的形态。结论 制首乌、北沙参、紫丹参3味药联合应用能够改善肝细胞超微结构，抑制肝细胞的凋亡，具有保护肝细胞、抗衰老的功效。

【关键词】  制首乌 北沙参 紫丹参 抗衰老 肝细胞 超微结构

　　Abstract：ObjectiveTo study the effects of Polygonum multiflorum Thumb., Adenophora paniculate and Radix Salviae Miltiorrhizae in protecting liver and anti-aging. Methods Aging models were made by hypodermic injection of D-galactose. The rats were given intragastrically with the decoction of Polygonum multiflorum Adenophora paniculate and Radix Salviae Miltiorrhizae at the same time. The morphologic changes in the liver cells were observed by transmission electronic microscope after 40 days. ResultsThe volume of liver cells of aging model group shrinked, the cell nuclear and the cell organ were seriously damaged.The volume of liver cells of herbs cure group were normal,and the cell nuclear and the cell organ were conserved well,they were similar in morphous to normal control group.ConclusionThe combinated application of Polygonum multiflorum，Adenophora paniculate and Radix Salviae Miltiorrhizae plays the notable role in improving the ultrastructure of liver cells and delaying the process of senescence.

　　Key words：Polygonum multiflorum Thumb.;  Adenophora paniculate;  Radix Salviae Miltiorrhizae;  Anti-aging;  Liver cell;  Ultrastructure
   
　　肝脏是机体物质代谢的关键脏器，肝脏的年龄变化是研究机体老化的一个重要指标。而肝脏的老化主要表现在其超微结构的改变、组织细胞的凋亡。本实验用3味中药合剂灌胃后对衰老大鼠肝脏的超微结构进行了透射电镜观察，研究制首乌、北沙参、紫丹参3味中药的保肝抗衰老作用。

　　1  材料

　　1.1  药物和试剂中药由制首乌、北沙参和紫丹参3味药组成，由河北医科大学第三医院制剂室制成口服液。D-半乳糖由上海试剂二厂生产。

　　1.2   动物采用2月龄Wistar雄性大鼠30只，体重为149～152 g，由河北医科大学实验动物中心提供。

　　1.3  仪器日立H600型透射电镜（日本日立公司生产）。由河北医科大学电镜室提供。

　　2  方法

　　2.1   动物的分组与模型制备将实验动物随机分为3组，每组10只。正常对照组：正常大鼠；衰老模型组：大鼠每日颈背部皮下注射D-半乳糖100 g/kg，连续注射40 d，形成糖代谢紊乱所致的亚急性衰老模型；中药治疗组：上述造模的同时，给予制首乌、北沙参、紫丹参3味药制成的口服液（以下简称中药）灌胃4 ml/次，2次/d，持续40 d。40 d后处死所有实验动物，取肝脏组织，观察其超微结构的变化。

　　2.2  实验标本的采集各大鼠于40 d后股动脉放血处死，迅速取出肝脏组织，将肝脏组织切成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，固定于4%戊二醛磷酸缓冲溶液中，4℃，保存1 h；PBS冲洗；1%锇酸，4℃，后固定1 h；PBS冲洗；50%，70%，80%，90%，100%，100%乙醇梯度脱水；100%丙酮浸透15～30 min；包埋剂包埋；分别在37，45，60℃，各24 h聚合；用超薄切片机切成50 nm的超薄切片；醋酸铀和柠檬酸铅双重电子染色；透射电镜观察照相。

　　3  结果
   
　　正常对照组：肝细胞体积大小正常，细胞核染色质均匀分布，核膜完整，无变形（箭头1)；细胞质内有大量的线粒体、粗面内质网、游离核糖体，线粒体嵴较完整(箭头2），粗面内质网无脱颗粒现象（箭头3）。见图1～2。

　　图1  正常对照组肝细胞核（×3 500）（略）      

　　图2  正常对照组肝细胞器（×20 000)

　　衰老模型组：肝细胞体积缩小，细胞核染色质浓缩，电子密度增加，边集于核膜下，厚薄不均，有的部分形成半月，部分核膜不整形（箭头1）；细胞质中线粒体体积缩小、数量减少，部分和大部分嵴融合消失（箭头2），粗面内质网有轻度脱颗粒现象（箭头3），糖元数量基本正常（图3～4）。图3  衰老模型组肝细胞核染色质边集呈新月形（×3 500） （略）

　　图4  衰老模型组线粒体嵴大部分消失、粗面内质网脱颗粒(×20 000)（略）
  
　　中药治疗组：肝细胞体积正常，细胞核染色质较均匀分布，部分核膜不整形（箭头1）；细胞质中各细胞器无明显变化，线粒体和粗面内质网体积数量均正常（箭头2，3），可见初级溶酶体（图5～6）。

　　图5  中药治疗组核膜稍不整形(×4 000) （略）   

　　图6  中药治疗组线粒体、粗面内质网无明显变化(×20 000)（略）
                        
　　4  讨论
   
　　衰老是机体生化反应的综合过程,衰老时伴自由基代谢的紊乱,而清除自由基的相关酶活性降低等多种因素均是导致机体发生衰老的重要原因。本实验通过D-半乳糖连续皮下注射使机体细胞内半乳糖浓度增高，在醛糖还原酶催化下生成醛糖醇,这种物质不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内,造成细胞代谢紊乱,破坏并消耗机体抗氧化物质,并不断产生自由基导致组织细胞受损，从而制成大鼠的亚急性衰老模型。
   
　　肝脏是机体物质代谢的关键脏器，肝细胞的损伤和凋亡是机体衰老的重要标志。肝细胞的凋亡主要表现在细胞核染色质的凝集、线粒体和粗面内质网数量和形态的改变。1972 年Kerr［1］提出细胞凋亡主要形态表现在细胞核染色质的凝集，这至今仍是检测凋亡细胞的形态指标。现代医学认为［2］衰老是由于生物体内染色质DNA受损后，机体修复损伤DNA能力下降，导致损伤的DNA积累引起。祖国医学认为衰老是由于肾气虚衰、阴阳失调所致。有学者认为，在生物体细胞核内存在DNA(物质)，属于祖国医学的“阴”，而“DNA的功能”属“阳”。衰老时染色体DNA损伤增加，即“阴”不足，因此抗衰老方剂均具有滋阴作用［3］。本实验所用的三味药中的北沙参即是滋阴补益的良药，它可补充衰老的染色质DNA，从而达到抗衰老的功效。
   
　　线粒体产生的ATP是细胞内的主要能量来源，其性状改变与衰老过程密切相关。有人称线粒体为衰老的生物钟。在生理活动旺盛的细胞中，线粒体数量较多，反之较少。国外很早就有报道，随着年龄的增长，多种组织中线粒体功能都出现了衰退，包括线粒体数量的减少［4］。线粒体具有直接利用氧气制造能量的功能，但是氧分子有两面性，一方面生物体利用氧分子制造能量，另一方面氧分子在被利用的过程中的活性氧自由基可伤害生物体造成氧毒性。线粒体在利用氧分子的同时也不断受到氧毒性的伤害，当它的损伤超过一定限度，细胞就会衰老死亡。制首乌、北沙参、紫丹参3味中药均具有抗氧化的功效。北沙参的主要有效成分香豆素类（亦称内酯类）具有明显的抗氧化活性。袁旭等［5］和Takao Kaneko［6］分别研究滨蒿内酯和七叶内酯证明它们均是通过清除氧自由基来控制炎症反应，保护细胞不受过氧化物损害。研究人员认为这些香豆素分子结构中所含的酚羟基是其具有抗氧化活性的关键所在［7］。紫丹参的主要有效成分之一总丹参酮类可与脂质中碳中心自由基(R·)复合成稳定自由基(AH-R·),从而抑制或阻止脂质的氧化［8］。而制首乌则能够通过保护超氧化物歧化酶，抑制单胺氧化酶的活性，达到抗氧化的功效。
   
　　粗面内质网是细胞中合成蛋白质的主要场所，粗面内质网的表面附着大量核糖体颗粒，细胞核内的遗传信息被带到这里进行“翻译”而合成蛋白质。同时，粗面内质网是判断细胞分化程度的指标。成熟、分化程度高、恶性程度低的细胞，粗面内质网含量较多；相反，不成熟、分化程度低、恶性程度高的细胞，粗面内质网含量较少，游离核糖体较多。因此，粗面内质网数量及形态的改变标志着细胞衰老、损伤甚至恶化的程度。实验中观察到衰老组大鼠肝细胞粗面内质网数量减少，并出现脱颗粒现象，而用药后数量增加，且脱颗粒现象明显减轻。
   
　　总之，本实验通过对肝细胞超微结构的观察表明：3味中药灌胃后，肝细胞体积恢复正常，细胞核染色质均匀，线粒体和粗面内质网的数量、形态均恢复正常。可见，3味中药具有保护肝细胞，延缓机体衰老的作用。其作用机制如上所述可能与它们的滋阴、抗氧化等功效有关。制首乌、北沙参、紫丹参3味中药是祖国医学的传统经典用药，其功效和作用远不止以上所述，因此他们保肝、抗衰老的作用机制是否还与其它功效有关尚需进一步研究证实。

【参考文献】
  　　［1］ J Kerr JFR,wylie AH,currie AR.Apoptosis:a basic biologic phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics［J］.Br J cancer,1972，26：239.

　　［2］ 王继峰,齐治家,王 浩,等.生物化学［M］.北京：中国科学技术出版社，2001：340.

　　［3］ 刘群良,胡 梅,吴 琼,等.抗衰延寿方对小鼠染色质结构与功能损害的影响［J］.中国临床康复，2004,8(36)：8258.

　　［4］ 孙青菊，朱克军，王学敏，等.线粒体与衰老相关研究进展［J］.中国老年学杂志，2005，25(9)：1135.

　　［5］ 袁 旭，李 智，刘洪瑞，等.滨蒿内酯对哮喘豚鼠气道炎症的抑制及其清除氧自由基作用［J］.中国医科大学学报,2002,31（6）：404.

　　［6］ Takao Kaneko,et al.Protection of coumarins against linoleic acid hydroperocide-induced cytotoxicity［J］.Chemico-Biological Interactions,2003, 142(3)：239.

　　［7］ T.B.Ng,et al.Anti-oxidative activity of natural products from plants ［J］.Life Science,2000,66(8):7093.

　　［8］ 孙丽芹,董新伟,刘玉鹏,等.脂类的自动氧化机理［J］.中国油脂，1998,23(5)：56.