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作者：汤新慧 高静 陈瑾 徐力致
【摘要】 目的研究中华补血草根提取物（the Limonium sinense Ktze root extract, LSE）对小鼠急性肝损伤的防护作用及药理机制。方法建立小鼠四氯化碳（CCl4）肝损伤模型，检测LSE对血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性的影响；观察肝细胞超微结构的变化；测定肝线粒体膜电位以及线粒体对高钙诱发肿胀的敏感性的变化。结果一定剂量（100～400 mg/kg）LSE能有效抑制CCl4引起的小鼠血清AST及ALT活性的显著上升；明显减轻肝损伤引起的小鼠肝脏线粒体形态结构的破坏；抑制线粒体膜电位的降低以及线粒体对外加高钙诱发肿胀敏感性的下降。结论 LSE对CCl4诱导的急性肝损伤具显著的防护作用，其机理可能与保护肝脏线粒体有关。
【关键词】 中华补血草 四氯化碳 肝损伤 线粒体
Abstract:ObjectiveTo study the hepatoprotective effect of Limonium sinense (Girard) Ktze root extract (LSE) and the possible mechanisms underlying its protection on acute liver injury induced by carbon tetrachloride (CCl4). Methods CCl4-induced liver injury model was used to evaluate the effect of LSE on the activities of serum aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) in mice. Ultrastructure of liver was observed and liver mitochondrial membrane potential and mitochondrial swelling were measured following CCl4 injection without or with LSE. ResultsWith oral pretreatment of 100 mg/kg, 200 mg/kg or 400 mg/kg LSE, the increase in serum AST and ALT activities induced by CCl4 were obviously reversed and significant morphological changes in liver mitochondria were remarkably lessened. In addition, the decrease in mitochondrial membrane potential and sensitivity of mitochondrial swelling to the exotic Ca2+ stimulation induced by CCl4 were also prevented by LSE. Conclusion LSE has hepatoprotective activity and the mechanisms underlying its protective effect may be related to its protection on liver mitochondria.
Key words imonium sinense (Girard) Ktze; Carbon tetrachloride; Liver damage; Mitochondria
中华补血草Limonium sinense (Girard) Kuntz 系白丹花科补血草属多年生泌盐草本植物，喜生于沿海盐渍化的低洼湿地上，广泛分布于我国东北、华北及陕、甘、宁和苏北等地区。除具有较高观赏价值、环境保护等作用外，具有一定药用价值。成分分析表明，该植物化学成分十分丰富，含有多糖、鞣质、萜类、黄酮类，以及氨基酸、矿物质等［1～2］。据记载，该植物具有补血、止血、散淤、调经、益脾、健胃等多种功效。然而，关于该植物的药理研究和临床应用相对滞后，目前中华补血草药理作用的研究主要集中在其抗菌止血方面，临床上主要用于治疗功能性子宫出血症［3］。最新的研究初步发现，中华补血草提取物能抑制CCl4及D-GalN肝损伤动物血清转氨酶活性的升高［4］，提示该植物可能具有对抗肝损伤作用。然而中华补血草的护肝作用还缺乏全面、深入的研究，其药理机制有待于进一步考察。
本研究拟采用CCl4小鼠急性肝损伤模型，运用肝细胞超微结构观察，酶活力测定以及线粒体膜电位测定、肿胀敏感性测定等方法，研究中华补血草根提取物（LSE）对小鼠急性肝损伤的防护作用并探讨其药理机制。
1 材料和方法
1.1 中华补血草根提取物（LSE）的制备中华补血草采集于江苏盐城滩涂，由江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室于延球副教授鉴定。取中华补血草干燥全根100 g，粉碎，用蒸馏水提取1～3次，合并提取液，浓缩、干燥，即得棕色干粉32.9 g（得率32.9 %）。
1.2 仪器与试剂7520分光光度计，上海分析仪器厂； Biofuge Primo R 冷冻离心机，Kendro 公司；Hitachi 7600-020全自动生化分析仪、Hitachi 850型荧光分光光度计，日立公司； Flexi-DryTM冷冻干燥仪，Stone Ridge公司；JEM100CX透射电子显微镜，日本电子公司。
罗丹明（Rh123），甘露醇、蔗糖、EDTA、琥珀酸、鱼藤酮，购自Sigma公司；Tris-HCl，Hepes，购自Promega公司。
1.3 动物 ICR小鼠，雄性，体重18～22 g，购自南京医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（苏）2002-0031。
1.4 方法
1.4.1 动物分组与给药方法 小鼠分5组：正常组、CCl4损伤组、100，200，400 mg/kg LSE组。正常组和损伤组小鼠以0.2 ml/10 g体重生理盐水连续灌胃5 d，LSE各剂量组则分别以不同浓度LSE同样方式灌胃；第6天正常组小鼠按10 ml/kg腹腔注射橄榄油，其余组小鼠腹腔注射0.15% CCl4 (溶于橄榄油中，10 ml/kg)。18 h后，取血，分离血清，待测血清ALT，AST活力。处死小鼠后，取部分肝组织固定，待制备肝组织电镜切片，其余肝组织匀浆，制备肝脏线粒体。
1.4.2 生化检测 分离得到的各组小鼠血清，全自动生化分析仪测定血清ALT及AST活性。
1.4.3 形态学观察 所取各组小鼠肝组织，4%戊二醛溶液预固定，1%四氧化锇再固定，制备肝组织电镜切片，透射电子显微镜观察肝细胞超微结构。
1.4.4 线粒体的制备以及膜电位和肿胀度的测定 据Apprille法制备肝脏线粒体，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度［5］。
按照Emaus法，使用荧光染料罗丹明（Rh123）测定线粒体的膜电位值(△Ψm)。测定时各处理组小鼠线粒体按0.5 mg/ml重悬于测定缓冲液中，在25℃条件下分别与0.3 mmol/L Rh123共孵3 min后，荧光分光光度计测定各组线粒体悬液的荧光强度（激发波长505 nm，发射波长534 nm），并计算膜电位的值。计算公式为：△Ψm=-59 log ［Rh123］in/［Rh123］out［6，7］。
线粒体肿胀程度根据线粒体悬液在波长为540 nm 处的吸光值测定。各组小鼠肝脏线粒体按1.0 mg/ml重悬于测定缓冲液中，于30℃条件下，测定各组线粒体悬液加入不同浓度氯化钙后5 min时吸光度的减少值，以此吸光度的减少值作为衡量线粒体肿胀程度的指标，比较各组线粒体诱发相同肿胀程度所需Ca2+浓度，诱发同等程度的肿胀所需的Ca2+浓度越高，表明该线粒体敏感性越低，说明损伤越严重［8，9］。
1.5 统计方法 进行单因素方差分析（one way analysis of variance，one way ANOVA），各处理组的组间差异采用SNK-q（Student Newman Keuls-q）检验进行比较。显著性水平取α=0.05。
2 结果
2.1 LSE对小鼠血清酶活力的影响由表1可看出，CCl4损伤小鼠的sAST及sALT活性显著升高（P<0.01），而预先以不同剂量LSE灌胃给药的小鼠sAST及sALT活性均显著低于损伤组（P<0.01），其中200，400 mg/kg LSE组小鼠sAST及sALT活性已恢复至正常，表明LSE对CCl4诱发的急性肝损伤有明显对抗作用。
表1 LSE对CCl4诱导的急性肝损伤小鼠酶活力的影响（略）
与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与CCl4组比较 ##P<0.01；n=8 2.2 LSE对小鼠肝细胞超微结构的影响正常小鼠肝细胞线粒体具完整双层膜结构，嵴的排列整齐有序。CCl4损伤组中肝细胞线粒体发生明显肿胀，外层膜结构不完整，线粒体内嵴变形、断裂、排列紊乱、疏松，严重者嵴完全消失，内室基质颗粒消失，出现空泡变性。而各LSE组小鼠肝细胞线粒体结构均有所改善，尤其是400 mg/kg LSE处理组，其线粒体形态和结构基本恢复正常，嵴的排列趋向整齐、有序，与正常组的小鼠肝细胞形态结构无明显差异。结果见图1。
图1 小鼠肝脏超微结构图（×12 000）（略）
2.3 LSE对小鼠肝脏线粒体膜电位的影响 各处理组小鼠肝脏线粒体的膜电位值见图2。正常小鼠的线粒体膜电位值为（-192.0 ±7.9）mV ，CCl4损伤后小鼠肝脏线粒体膜电位值下降为（-163.1 ± 6.1） mV (15.1 %，P<0.01)。而预先以各剂量LSE处理的小鼠肝脏线粒体膜电位的值则有所回升。200，400 mg/kg LSE组小鼠肝脏线粒体的膜电位值与正常小鼠无差异，即完全对抗了CCl4诱导的线粒体膜电位的降低。
与正常组比较，**P<0.01；与CCl4组比较 ，**P<0.01；n=8
图2 LSE对小鼠肝脏线粒体膜电位的影响（略）
aCa2+诱发线粒体肿胀的量效曲线； b各组小鼠线粒体诱发相同程度肿胀所需Ca2+浓度;与正常组比较，**P＜0.01；与CCl4组比较，#P＜0.05，##P＜0.01
图3 LSE对肝脏线粒体在体外对Ca2+诱发肿胀敏感性的影响（略）
2.4 LSE对小鼠肝脏线粒体肿胀敏感性的影响由图3可知，正常组小鼠肝脏线粒体在50 mmol/L Ca2+诱发下产生明显肿胀，其吸光度下降值为224.8，小鼠急性肝损伤后，诱发与正常组小鼠线粒体相同程度的肿胀所需Ca2+浓度达310.2 mmol/L，为正常组Ca2+浓度的6.2倍（P<0.01），预先给予100 ，200，400 mg/kg LSE灌胃处理的小鼠肝脏线粒体诱发相同程度肿胀所需Ca2+的浓度与损伤组相比有所减少，表明LSE可一定程度抑制损伤引起的肝脏线粒体敏感性下降，表明LSE对CCl4引起的线粒体肿胀有明显的保护作用。
3 讨论
CCl4急性肝损伤是筛选护肝药、研究药物作用原理的经典模型。CCl4进入体内后，经肝脏细胞色素P450激活，生成三氯甲基自由基，引发生物膜脂质过氧化，或与膜脂或蛋白质等大分子共价连结，破坏膜结构与功能完整，肝细胞膜的通透性增加，胞浆内的可溶性酶渗出，因而，血清ALT等酶的活性可灵敏反映肝细胞损伤、坏死的程度［10］。
本研究发现，一定剂量中华补血草根提取物能显著抑制CCl4引起的肝损伤小鼠血清ALT和AST活力的升高，这一结果表明LSE具有保护肝细胞浆膜、对抗肝损伤的作用，同时还提示，LSE对线粒体膜可能具有一定保护作用。因为80%的AST来源于线粒体，一般以ALT活性上升作为肝细胞浆膜损伤的标志，而AST活性升高则作为线粒体损伤的标志［11］。观察小鼠肝细胞的超微结构，发现LSE可明显改善损伤引起的肝细胞线粒体肿胀、外膜结构不完整、嵴变形、断裂、排列紊乱等，进一步提示，LSE的抗肝损伤作用与其对线粒体的保护作用有关。
越来越多的证据表明，在细胞损伤或坏死过程中，线粒体起着关键作用。许多疾病发生过程中均伴随着线粒体功能的改变，而线粒体功能缺陷可导致人类和动物多种疾病的发生。最新研究已经证实，在肝损伤过程中伴随着线粒体功能的改变，而某些护肝药物可以通过保护肝脏线粒体，从而发挥肝脏保护作用［7，12，13］。因此，本研究以肝脏线粒体为靶点，通过分离肝脏线粒体，以线粒体膜电位及线粒体对钙诱发肿胀的敏感性为指标，考察LSE对肝损伤小鼠肝脏线粒体的影响，以深入探讨LSE的护肝机制。
检测线粒体膜电位的值发现，CCl4能引起小鼠肝细胞线粒体膜电位一定程度下降，这与前面［7，11］的研究结果相吻合，而一定剂量LSE可完全逆转肝损伤引起的肝脏线粒体膜电位的下降，表明LSE对肝脏线粒体起显著保护作用。
运用体外高钙诱导线粒体肿胀模型，以诱发线粒体产生肿胀所需Ca2＋的浓度为指标，可比较线粒体的不同活性状态［8，9］。本研究比较正常、肝损伤及预先用LSE灌胃处理的小鼠肝脏线粒体发现，正常小鼠线粒体对高钙敏感，外加 50 mmol/L Ca2＋即产生明显肿胀；而急性损伤小鼠肝脏线粒体需加6.2倍的Ca2＋才能诱发相同程度的肿胀，表明小鼠肝脏线粒体对高钙诱发肿胀的敏感性因肝损伤而有明显下降。预先给予LSE灌胃处理的小鼠肝脏线粒体诱发相同程度肿胀所需要的Ca2＋浓度与肝损伤小鼠相比有不同程度回升，提示LSE可一定程度维持对钙诱发肿胀的敏感性。以上结果进一步证实了LSE对肝细胞的保护作用与其肝脏线粒体保护作用密切相关。
综上所述，本研究探讨了LSE的护肝作用及机制，发现LSE 可显著对抗CCl4诱导的小鼠急性肝损伤，其药理机制可能与其对线粒体的保护作用有关。
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发表于 2014-8-19 18:17:35
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