Fascin基因在骨肉瘤中的表达及统计分析

jz066520 · 发表于 2014-6-7 10:06:26

【摘要】  目的：探讨Fascin基因在骨肉瘤组织中的表达及及统计分析。方法：收集武汉市四大三级甲医院的骨肉瘤20例及良性骨软骨瘤5例,将实验分为骨肉瘤组(n=20)和良性骨软骨瘤组(n=5),采用免疫组织化学方法检测各组组织中Fascin基因的表达水平, 采用HPIAS 1000图文报告管理系统对Fascin基因的表达进行定量分析，并用SPSS11.5软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q)检验。结果：Fascin基因在骨肉瘤组织中呈高表达, Fascin基因在良性骨软骨瘤组织中呈低表达, Fascin基因在骨肉瘤组织中的表达与良性骨软骨瘤组织的表达比较差异有显著性(P<0.05)。结论：Fascin基因在肿瘤发生、生长、转移等过程中有促进作用，提示Fascin基因可能与骨肉瘤的发生、发展有关。

【关键词】  骨肉瘤; Fascin基因; 免疫组织化学; 图像分析; 统计分析

骨肉瘤是青春期正常骨骼快速生长相应发病高峰期最常见的原发性恶性肿瘤。其发生率约为0.1/10万, 其恶性度高，进展快，预后差，且以青少年好发。多发于10～20岁的青少年的长骨, 尤以股骨下段和胫骨上段多见[1]。占骨恶性肿瘤的20%左右,肺转移是其主要死亡原因,80%的病例在确诊时已有肺部微小转移灶。骨肉瘤早期临床症状无特异性,且病情进展较快,大多数病例就诊时已经进入临床ⅡB期[2～4]。Fascin基因属于fascins家族,其蛋白质编码产物是一种结构独特、进化保守的肌动蛋白( actin)交联蛋白,位于细胞膜皱褶、微棘及应力纤维,在各种转化细胞中促使细胞膜突起并增加细胞运动性。近年来的研究发现, fascin在许多恶性肿瘤组织细胞中表达上调,在恶性肿瘤的进展中起重要作用[5～7]。研究通过应用免疫组织化学方法和图像分析技术检测骨肉瘤及良性骨软骨瘤组织中fascin基因的表达水平，并进行了统计学分析，探讨Fascin基因在骨肉瘤发生、发展过程中的作用机制，为临床上防治骨肉瘤提供理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 材料来源及分组收集武汉市四大三级甲医院病理科2000～2008年骨肉瘤存档蜡块20例及良性骨软骨瘤存档蜡块5例。所有切片经病理学专家诊断为骨肉瘤及良性骨软骨瘤。

　　1.1.2 材料采用免疫组织化学SP法检测Fascin基因在骨肉瘤与良性骨软骨瘤组织中的表达。

　　1.2 主要试剂和仪器

　　1.2.1 主要试剂

　　①Fascin兔抗人多克隆抗体(北京中山生物技术有限公司);②超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒(福州迈新公司);③DAB显色试盒及多聚赖氨酸(北京中山生物技术有限公司)。

　　1.2.2 主要仪器 ① YWY781型医用微波仪，250 W，50 Hz (浙江临安电子器材厂生产);② 家用高压锅;③ 电热恒温干燥箱 (湖北黄石医疗器械厂生产);④ 显微镜成像系统 (Olympus公司)。

　　1.3 方法

　　蜡块切片厚5μm，贴片于涂有多聚赖氨酸的洁净载玻片上，置于烤箱烤干待用。免疫组织化学SP法检测Fascin基因相关抗原具体步骤：① 4μm组织切片常规脱蜡至水后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;② 抗原修复(柠檬酸缓冲液微波抗原修复法)，室温自然冷却后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗5×3 min;③ 滴加3%过氧化氢，37℃湿盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;　　④ 正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景;⑤ 甩去多余血清，分别滴加一抗，4℃孵育过夜，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5 min;　　⑥ 滴加生物素标记的二抗37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;⑦ 滴加链霉素抗生物素蛋白过氧化物复合物37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;⑧ 滴加新鲜配置的DAB显色液显色，光镜下控制反应时间(约3～5 min)，自来水冲洗终止反应;　　⑨ 苏木素复染，流水冲洗，1%盐酸酒精分色数秒，流水冲洗，0.1%氨水返蓝;⑩ 梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检;用PBS代替一抗作为阴性对照组，购买的阳性片作为阳性对照组。　　1.4 免疫组织化学结果判断

　　Fascin阳性染色为棕黄色颗粒，定位于细胞核和胞质内。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。采用HPIAS1000 高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对Fascin基因的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400) ,测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积,计算阳性面积率(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。

　　1.5 统计学处理

　　数据以均数±标准差表示，用SPSS11. 5 软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q) 检验，检验水准α为0.05。

　　2 结果

　　Fascin基因的表达：在骨肉瘤组中可见密集分布的棕黄色颗粒，Fascin基因表达呈阳性;在良性骨软骨瘤组中可见少量的棕黄色颗粒，Fascin基因表达弱阳性或阴性。图像分析结果显示: 骨肉瘤组Fascin基因表达的平均光密度为0.2659±0.009, 良性骨软骨瘤组Fascin基因表达的平均光密度为0.0886±0.0043; 骨肉瘤组Fascin基因表达的阳性面积率为0.2994±0.0080, 良性骨软骨瘤组Fascin基因表达的阳性面积率为0.0987±0.0056,经单因素分析骨肉瘤组与良性骨软骨瘤组比较，差异有显著性(P<0.05)。见表1。表1 骨肉瘤组与良性骨软骨瘤组Fascin基因表达的平均光密度和阳性面积率

　　3 讨论

　　原发性恶性骨肿瘤是罕见的，只占所有新癌症病例的0.2%。这些罕见肿瘤的治疗是复杂的，对骨外科来说是一项重大的挑战。骨肉瘤是青春期正常骨骼快速生长相应发病高峰期最常见的原发性骨肿瘤。近年来强度新佐剂和佐剂化疗的使用使得这种疾病患者得以存活。无复发存活率已经从没有进行化疗的不足20%提高到了使用手术和多代理化疗相结合治疗的55%～70%[8～10]。完全手术切除和术前化疗良好的组织学反应是患者疾病定位最重要的预后指标。患者术前化疗反应良好(>90%坏死)5年存活率为75%～80%，与此相比那些化疗反应差的(<=90%坏死)为45%～55%。尽管整体存活率(OS)有所提高，但是有相当一部分患者会发展为复发性疾病，这种情况最常见于肺部转移[11～12]。因此需要一线治疗的新方法来提高存活率。这种罕见癌症治疗的新方法是临床研究者最大的挑战。因此, 近些年有许多学者着重研究骨肉瘤的分子发病学, 为观察骨肉瘤预后和转移寻找新的指标, 也为寻找骨肉瘤新的治疗方法提供了理论基础。

　　人类Fascin基因是由Bryan等[13]20 世70 年代从海胆母细胞中发现的,其蛋白质编码产物是一种分子量为55 kDa 的细胞骨架蛋白[14～15],Fascin蛋白N端11～50之间的氨基酸残基高度保守,其中第39位的丝氨酸为蛋白激酶C的磷酸化位点,该位点的磷酸化可调节Fascin蛋白与F肌动蛋白的结合活性以及细胞膜表面丝状伪足和微棘的形成,提示Fascin蛋白可能在细胞迁移、细胞黏附以及细胞间信息交流等过程中发挥作用[16，17]。研究发现, 在正常上皮细胞中Fascin表达较低或缺失, 然而在胃癌、肺癌、食管癌等恶性肿瘤中Fascin1 表达上调[18～20]。

　　本实验结果显示，Fascin基因在骨肉瘤的表达明显高于对照组(P<0.05)，骨肉瘤组与对照组比较(P<0.05)，差异有显著性。Fascin蛋白是一种进化保守的、与肌动蛋白结合的55 kDa的细胞内蛋白,它的主要功能是与肌动蛋白结合,并将其捆绑成平行的肌动蛋白束,使细胞形成线状(filopodia)或片足( lamelipodia)的突起,从我们的结果中说明Fascin使肿瘤细胞的运动性增加,侵袭转移能力增强。结果证实Fascin基因在肿瘤发生、生长、转移等过程中有促进作用，提示Fascin基因可能与骨肉瘤的发生、发展有关。Fascin可作为判断骨肉瘤生物学行为的新参考指标。

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