RPHPLC测定克淋通片中槲皮素的含量

jz066520 · 发表于 2014-6-2 10:43:14

【摘要】  目的：建立高效液相色谱法测定克淋通片中槲皮素含量的方法。方法：色谱柱为伊利特Hypersil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5um)，流动相为甲醇0.3%磷酸溶液(51：49)，流速为1.0mL/min，检测波长为370nm。结果：槲皮素检测浓度在1.80～9.02ug/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9998);平均加样回收率为97.8% ，RSD=2.36%。结论：该方法简便、快速、准确，可用于克淋通片的质量控制。

【关键词】  克淋通片; 槲皮素; 含量测定; 高效液相色谱法

　克淋通片由四季红，黄柏组方，有清热泻火，利尿通淋之功效。临床上用于湿热下注，热结膀胱所致的热淋，症见小便频数，尿急、尿痛、小腹胀痛，腰痛等症状。四季红为处方中的君药,具有抗菌，抗炎等作用。为了提高中药产品的质量标准，达到质量可控，对该制剂中的槲皮素进行了HPLC含量测定。实验证明：该方法准确可靠，重现性好，为克淋通片的质量控制提供了准确可靠的新技术、新方法。

　　1 仪器与试药

　　洛尔高效液相色谱仪，紫外检测器，Echrom2000工作站，METTLER AE260电子天平。甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，水为重蒸水，槲皮素对照品(100081200406，中国药品生物制品检定所)，克淋通片。

　　2 方法与结果

　　2.1 色谱条件

　　采用依利特Hypersil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5um); 流动相：甲醇0.3%磷酸溶液(51：49);检测波长：370nm;流速：1.0 mL/min。

　　2.2 溶液的制备

　　2.2.1 对照品溶液的制备精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇制成浓度为5ug/mL 的对照品溶液。

　　2.2.2 供试品溶液的制备取本品10片，研细，混匀，取0.6g，精密称定，置磨口具塞锥形瓶中，精密加入甲醇15mL、20%盐酸溶液10mL，密塞，称定重量，水浴回流2 h，放冷，称重，用甲醇补充减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取5mL续滤液，置10mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

　　2.2.3 阴性对照溶液的制备按原处方工艺制备不含四季红的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备。

　　2.3 系统适应性试验

　　分别精密吸取槲皮素对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20u L注入液相色谱仪。结果发现，供试品与对照品图谱在相同的保留时间内出现同样的峰，与邻近峰分离完全;阴性对照溶液图谱上相应保留时间处无色谱峰出现，表明阴性无干扰。色谱图见图1。

　　A.槲皮素对照品; B.供试品; c.阴性对照

　　图1 高效液相色谱

　　2.4 线性关系考察

　　精密称取槲皮素对照品56.4mg，加甲醇溶解并定容至50 mL，摇匀，精密量取此溶液2mL置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度为45.1ug/mL 的贮备液;分别精密吸取此贮备液1、2、3、4、5mL，置25 mL量瓶中，加流动相稀释并定容至刻度，摇匀。分别精密吸取上述溶液各20uL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以对照品检测浓度(x)为横坐标，峰面积积分值(y)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为Y=65387X-349(r=0.9998)。结果表明，槲皮素检测浓度在1.80～9.02ug/mL 范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。　2.5 精密度试验

　　精密吸取对照品溶液20ul，按上述色谱条件重复进样5次，测定。结果RSD=2.26%，表明仪器精密度良好。

　　2.6 稳定性试验

　　取供试品溶液(批号：080721)，按上述色谱条件于0、4、8、16、24 h时测定峰面积。结果RSD=2.37%，表明在24h内供试品溶液中槲皮素的含量稳定。

　　2.7 重现性试验

　　取同一批样品(批号：080721)5份，各约0.6 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定槲皮素的峰面积并计算含量。结果RSD=1.98% ( n=6)，表明方法重现性良好。表1 加样回收率测定结果表(n=6)

　　2.8 加样回收率试验

　　精密称取已知含量为360ug/g的样品粉末6份，每份约0.6g，精密称定，分别精密加入槲皮素对照品溶液(247ug/ml)1 mL，按供试品项下方法制备6份溶液，依法测定，计算加样回收率，结果见表1。

　　2.9 样品含量测定

　　分别精密称取5个批号的克淋通片样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算样品中槲皮素的含量。结果，5批样品的平均含量为374.4ug/g，每片片重规格为0.25g，平均每片含槲皮素93.6ug。表2 样品测定结果

　　3 讨论

　　根据参考文献，考察了不同比例的甲醇磷酸溶液作为流动相，当甲醇0.3%磷酸溶液比例为51:49时，槲皮素峰形最佳，吸收峰分离度好，保留时间适中。

　　槲皮素的存在形式有游离型和槲皮素3阿拉伯糖苷，要先经水解为游离型后方可被提取和测定。本研究采用加酸水解法，水解条件选择分别加入5%、10%、20%的盐酸溶液进行比较。结果表明，加入5%、10%盐酸溶液，水解不完全，槲皮素含量低;而加入20%盐酸溶液则水解完全，槲皮素含量高，故选用加入20%盐酸溶液。

【参考文献】
  　1 贵州省食品药品监督管理局.贵州省中药、民族药材质量标准.第1版.贵阳：贵州科技出版社，2003，149.

　　2 陈秋晨，王琳，刘振，等.HPLC测定四季红药材中槲皮素的含量.解放军药学学报，2008，24(4)：365～367.

　　3 龙凤荣，孙敏.HPLC法测定热林清胶囊中槲皮素的含量.中成药，2007，29(4)：613.

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